FAAP基因敲除小鼠模型的構建和表型初步分析.pdf

1、粘著斑相關蛋白（FAAP，focal adhesion associated protein）是由小鼠D10Wsu52e基因編碼的分子量為55kD的蛋白，進化上非常保守，在細菌、古生菌和后生動物中廣泛分布。在小鼠不同組織中的表達分析發(fā)現，FAAP在生殖器官中高表達，推測其是一個與生殖系統緊密相關的基因。為探索FAAP在雄性生殖系統中的功能，本實驗運用反轉錄PCR及Western Blot研究了FAAP在雄性生殖系統中的表達模式。結果顯示

2、，FAAP mRNA在睪丸、附睪、輸精管、前列腺中都檢測有表達，在精囊中未檢測到其表達，而睪丸和附睪中FAAP的表達量高。Western Blot檢測C57BL/6J雄性小鼠出生后第1、7、14、21、28、35、42天附睪及睪丸中FAAP蛋白表達量發(fā)現，FAAP蛋白的表達量隨出生后天數而逐漸增加。這表明FAAP可能在小鼠附睪形態(tài)發(fā)育、功能維持和精子成熟中起作用。實驗可以作為 FAAP基因敲除小鼠的野生型對照組來觀察敲除組和野生型不同發(fā)

3、育時期附睪和睪丸中FAAP的表達變化，進而為觀察不同發(fā)育時期小鼠的附睪形態(tài)、精子形態(tài)和受精能力做鋪墊。
　　利用基因打靶技術構建FAAP基因敲除小鼠模型：KO（knockout)-First基因敲除小鼠模型。KO-First是一種多用途的模型，與條件敲除策略類似，在靶片段的兩側分別放置方向相同的loxP位點，同時還在靶片段5’端內含子中放置一個兩側帶有FRT位點的SA-IRES-reporter片段。這樣的模型可以用靶基因的啟動子

4、表達報告基因（reporter），通過檢測報告基因的表達即可了解靶基因的表達情況；與表達Flp的工具鼠交配可去除 SA-IRES-reporter片段，得到常規(guī)的flox小鼠。KO First模型的flox小鼠與conditional KO模型的flox小鼠不同，conditional KO中的flox小鼠表型正常，但KO First卻是KO表型。所以通過檢測 KO-First小鼠表型分析可以初步檢測FAAP KO表型。本實驗所用的KO

5、-First小鼠是插入了FRT-lacZneo-FRT-loxP元件及 loxP位點的基因敲除小鼠，帶有LacZ報告基因，可用LacZ染色定位檢測報告基因了解FAAP的表達情況，結果顯示，在KO-First小鼠的大腦和睪丸附睪中FAAP的表達量高。通過KO-First小鼠與C57BL/6J小鼠檢測繁殖力發(fā)現，與C57BL/6J雄鼠相比，KO-First小鼠受孕率明顯降低。KO-First小鼠后代從出生后14天左右開始出現死亡,在出生后第

6、28天至42天存活率低，很少有活過2個月的。表明 FAAP在小鼠生長發(fā)育過程中起了重要作用。FAAP KO First小鼠可與 Flper小鼠交配后去除FRT-lacZneo-FRT元件，得到常規(guī)的FAAP flox小鼠。FAAP flox小鼠與Defb41iCre/wtCre小鼠交配即可獲得在附睪特異性敲除FAAP的條件敲除小鼠。
　　本實驗利用KO-First基因敲除小鼠模型，可以進行FAAP基因敲除小鼠初步的表型分析，為定向