Zymomonas mobilis硫酸鹽還原途徑突變菌株的構(gòu)建及其產(chǎn)H2S與產(chǎn)醇評價.pdf

1、同化硫酸鹽還原途徑是微生物產(chǎn)生H2S的重要途徑之一。雖然生物信息學(xué)研究結(jié)果已經(jīng)顯示運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)中存在這一途徑,并預(yù)測了相關(guān)的基因,但是從實驗水平上對該途徑包括相關(guān)基因功能的驗證、途徑調(diào)控等還沒有報道。同時,我們發(fā)現(xiàn)Z.mobilis ZM4菌株在甜高粱汁發(fā)酵過程中會產(chǎn)生刺激性的惡臭氣體并被證實主要成分為H2S。因此,構(gòu)建Z.mobilis同化硫酸鹽還原途徑相關(guān)基因缺失的突變菌株并研究其H2S的產(chǎn)生

2、,對預(yù)測的Z.mobilis同化硫酸鹽還原途徑及相關(guān)基因功能的驗證,甚至對Z.mobilis整個硫代謝的認(rèn)識都具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究首先通過同源重組和FLP-FRT位點特異性重組的方法,成功構(gòu)建了Z.mobilis同化硫酸鹽還原途徑ATP-硫酸化酶(cysN,cysD編碼)失活的突變菌株ΔcysND-cat、ΔcysND和亞硫酸還原酶(cysI,cysJ編碼)失活的突變菌株ΔcysIJ-cat、ΔcysIJ,以及這兩個酶

3、同時失活的突變菌株ΔcysND-catΔcysIJ、ΔcysNDΔcysIJ-cat。
　　研究對突變菌株在不同碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、甜高粱汁)培養(yǎng)基中的產(chǎn)H2S情況進行了考察,結(jié)果表明突變菌株在所測試條件下均不產(chǎn)生H2S,而ZM4對照菌株在除含果糖外的培養(yǎng)基中均有H2S生成;培養(yǎng)基中添加SO32-時,只有ΔcysND-cat、ΔcysND菌株能夠恢復(fù)產(chǎn)生H2S,而其它突變菌株均不能恢復(fù) H2S的產(chǎn)生,ZM4菌株仍能夠產(chǎn)生H2

4、S,說明cysND、cysIJ與H2S的產(chǎn)生相關(guān),且CysND催化的反應(yīng)位于同化硫酸鹽還原代謝途徑中的中間產(chǎn)物SO32-之前,而CysIJ所催化的反應(yīng)位于SO32-之后。
　　研究同時考察了搖瓶中ΔcysND、ΔcysIJ以及ΔcysND-catΔcysIJ菌株分別在含10％葡萄糖和15%蔗糖的RM培養(yǎng)基及10%甜高粱汁中的生長和產(chǎn)醇情況,結(jié)果顯示:
　　(1)培養(yǎng)基中無SO32-添加時,三個突變菌株在兩種RM培養(yǎng)基中的生長

5、無明顯差別且與ZM4接近(最大OD600均約為5);含10%葡萄糖的RM培養(yǎng)基中突變菌株的最大產(chǎn)醇濃度分別為47.4g/L、48.3g/L和47.3g/L,均高于ZM4(46.7g/L);含15%蔗糖的RM培養(yǎng)基中突變菌株的最大產(chǎn)醇濃度分別為46.4g/L、46.2g/L和46.3g/L,均低于ZM4(47.7g/L);10%甜高粱汁中突變菌株的最大產(chǎn)醇濃度分別為35.0g/L、29.1g/L和34.7g/L,也均低于ZM4(46.2g

6、/L);
　　(2)培養(yǎng)基中添加SO32-時,含10%葡萄糖的RM培養(yǎng)基中,ΔcysND菌株的生長表現(xiàn)出24h的延滯期(ZM4延滯期為32h),最大OD600約為5(ZM4也約為5)與不加SO32-時的值接近,其最大產(chǎn)醇濃度為44.9g/L(ZM4為43.3g/L),而ΔcysIJ及ΔcysND-catΔcysIJ菌株的整個生長過程均受到完全抑制,產(chǎn)醇幾乎檢測不到;含15%蔗糖的RM培養(yǎng)基中,ΔcysND菌株的生長也表現(xiàn)出24h的

7、延滯期(ZM4延滯期仍為32h),但最大OD600約為5.5與ZM4接近,其最大產(chǎn)醇濃度為48.8g/L低于ZM4(51.2g/L),而ΔcysIJ以及ΔcysND-catΔcysIJ菌株的延滯期均約為40h,最大OD600為3～3.5,其最大產(chǎn)醇濃度分別為40.6g/L和48.6g/L。這些結(jié)果表明cysND和cysIJ的失活對突變菌株生長和產(chǎn)醇的不同影響在很大程度上取決于底物即碳源的種類。
　　此外,突變菌株在發(fā)酵罐中以10%