基于功能化納米顆粒的線粒體識別及細(xì)胞熒光成像研究.pdf

1、近年來，熒光納米材料優(yōu)良的熒光性質(zhì)使其在細(xì)胞及亞細(xì)胞層面的生物標(biāo)記研究中得到了廣泛的關(guān)注，為生物分析及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的技術(shù)手段和方法。本研究小組利用二氧化硅熒光納米顆粒開展了一系列生物標(biāo)記研究工作，但二氧化硅納米顆粒在亞細(xì)胞標(biāo)記中的研究還未有報道，本論文在實(shí)驗(yàn)室已有工作基礎(chǔ)上，開展了二氧化硅熒光納米顆粒用于線粒體標(biāo)記的相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒粒徑較大會影響亞細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪M(jìn)行，因此選擇小粒徑熒光材料金納米簇作為研究對象，考察其

2、作為細(xì)胞熒光標(biāo)記物的可行性。本論文主要從以下三個方面開展工作：
　　 1.信號肽功能化二氧化硅納米顆粒的離體線粒體靶向作用研究
　　 以N.(p.馬來酰亞胺基苯基)異氰酸酯(N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate，PMPI)為交聯(lián)劑，將線粒體信號肽分子共價修飾到二氧化硅熒光納米顆粒表面)構(gòu)建線粒體信號肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒。采用熒光分光光度計、Zeta電位儀以及透射電子顯微鏡對修飾前后的二氧

3、化硅納米顆粒進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上以分離純化的細(xì)胞核作為對照，采用流式細(xì)胞術(shù)考察了信號肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒與分離純化的線粒體間的相互作用。結(jié)果表明：信號肽成功修飾在二氧化硅納米顆粒表面，并且納米顆粒粒徑在信號肽分子修飾前后沒有發(fā)生明顯變化；同時，線粒體信號肽修飾到二氧化硅納米顆粒表面后依然保持良好的生物活性，能夠介導(dǎo)二氧化硅納米顆粒特異性識別及結(jié)合分離純化的線粒體，從而為線粒體監(jiān)測以及線粒體功能調(diào)控研究提供了新的思路。
　　

4、 2.信號肽功能化二氧化硅納米顆粒的活細(xì)胞線粒體靶向研究
　　 在上一章研究工作基礎(chǔ)上，以Hela細(xì)胞為研究對象，考察了線粒體信號肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒在活細(xì)胞內(nèi)的線粒體靶向情況。將信號肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒和Hela細(xì)胞共同培育，并利用LysoTracker Green和MitoTrackerDeep Red對細(xì)胞內(nèi)溶酶體及線粒體進(jìn)行染色，通過激光共聚焦顯微鏡對納米顆粒在Hela細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明

5、：功能化二氧化硅熒光納米顆粒能夠通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，但是未能實(shí)現(xiàn)線粒體靶向而是滯留于溶酶體。氯喹處理能夠破壞溶酶體膜的完整性，但在氯喹處理后二氧化硅熒光納米顆粒并未進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而是粘附于溶酶體膜上，仍滯留于溶酶體中。本章工作為納米顆粒用于亞細(xì)胞標(biāo)記提供了具有參考價值的信息，熒光納米顆粒在亞細(xì)胞標(biāo)記領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用有賴于發(fā)展分散性好、粒徑小、非特異吸附小的納米材料。
　　 3.牛血清白蛋白介導(dǎo)合成的金納米簇用于細(xì)胞熒光成像研究

6、
　　 在上一章研究工作中發(fā)現(xiàn)納米顆粒粒徑較大不利于亞細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪M(jìn)行，發(fā)展小粒徑熒光物質(zhì)對實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞標(biāo)記十分必要。近年來金納米簇因其熒光特性得到很大改善且具有粒徑小、無毒性等優(yōu)點(diǎn)而成為納米材料領(lǐng)域科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)并在熒光標(biāo)記研究中得到了一定應(yīng)用。本章以牛血清白蛋白介導(dǎo)合成了金納米簇，并利用熒光分光光度計，納米粒度及zeta電位儀和非變性聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)電泳進(jìn)行了表征；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了金納米簇與Hela細(xì)胞間的相互作用，同

7、時將其與生物素相交聯(lián)考察其用作熒光標(biāo)記物的可行性。結(jié)果表明：牛血清白蛋白.介導(dǎo)合成的金納米簇?zé)晒庑盘栞^強(qiáng)且在不同pH值溶液中熒光穩(wěn)定性好；與細(xì)胞共同孵育時可以通過內(nèi)吞作用進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，在優(yōu)化培育時間和金納米簇濃度的條件下可實(shí)現(xiàn)較好的活細(xì)胞熒光標(biāo)記效果，并且在經(jīng)過細(xì)胞固定化處理后仍可保持其標(biāo)記形態(tài)；此外生物素化的金納米簇可以識別及標(biāo)記鏈霉親和素包被的微珠。以上研究對于金納米簇作為一種新型熒光標(biāo)記物在活細(xì)胞熒光成像領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用具有一定