熒光氧氣納米傳感器的構建及在腫瘤細胞線粒體功能障礙評估中的應用.pdf

1、氧含量的檢測在醫(yī)學和生物學等領域有著非常重要的意義，熒光氧氣納米傳感器常被用于檢測細胞或組織的溶氧量。線粒體是有氧呼吸的主要場所，其代謝損傷會導致腫瘤等疾病的發(fā)生，基于溶氧量的檢測可表征線粒體的呼吸速率，進而評估腫瘤細胞線粒體的功能狀態(tài)。然而，當前的傳感器主要針對細胞外或者細胞內的溶解氧檢測，難以精確測定線粒體內的氧含量變化。本論文主要研究生物兼容高靈敏度熒光氧氣納米傳感器的構建，并通過對線粒體呼吸速率的熒光檢測，評估腫瘤細胞線粒體功能

2、障礙。
　　本論文的主要研究內容及結果如下:
　　1、利用再沉淀-包覆法制備摻雜氧氣熒光探針分子和參比物質的比率熒光氧氣納米傳感器，通過多聚賴氨酸大分子(PLL)的表面修飾使納米傳感器具有較低的毒性和有效的細胞攝取率。首先以PMMA和BTD為基質將疏水性的氧氣探針分子PtOEP和熒光參比分子C6封裝到納米顆粒內，隨后利用納米顆粒表面硅醇的負電性和PLL分子的正電性之間的靜電吸引，制備PLL包覆的PtOEP/C6摻雜的PMMA

3、基質熒光氧氣納米傳感器。該熒光氧氣納米傳感器的氧氣猝滅率為77％，可通過非線性Stern-Volmer公式進行擬合，由于PLL的修飾使其具有良好的生物相容性和較高的細胞攝取率。在此基礎上，我們利用PS代替PMMA，并且將可以進行能量傳遞的熒光團DNM與PtOEP、C6同時封裝到PS基質納米顆粒內，制備了PLL包覆的PtOEP/DNM/C6摻雜的PS基質熒光氧氣納米傳感器。該納米傳感器的氧氣猝滅率達到94％，其比率熒光與溶氧量之間具有良好

4、的線性關系，并且可以被細胞有效吞噬，在細胞內呈現(xiàn)良好的比率熒光成像。
　　2、通過碳二亞胺反應在PLL包覆氧氣納米傳感器表面修飾親脂性陽離子TPP，實現(xiàn)了對細胞線粒體的靶向定位。首先研究了PLL包覆納米顆粒的自組裝形成機理，認為采用10 mg/L的MH-PLL(Mw=30-70 kDa)包覆制成的納米顆粒具有最佳的形貌、大小和zeta電勢?；趜eta電勢方法和熒光胺方法對納米顆粒進行分析，發(fā)現(xiàn)PLL殼層中存在三種類型的氨基基團，

5、分別位于殼層的內部、中部和表面，其中表面氨基濃度為12 nmol/mL。通過碳二亞胺反應將TPP基團偶聯(lián)到納米顆粒表面，利用核磁共振和吸收光譜分析證明TPP偶聯(lián)修飾得到實現(xiàn)。對TPP偶聯(lián)納米顆粒進行共聚焦顯微鏡成像和斷層掃描成像，證明其可以被細胞有效攝取，并成功地靶向細胞線粒體。
　　3、制備了三類分別靶向細胞外、細胞內和線粒體內的熒光氧氣納米傳感器，基于時間分辨熒光方法檢測肝癌細胞HepG2和正常肝細胞LO2的呼吸效率，評估腫瘤

6、細胞線粒體的功能障礙。三類靶向性氧氣納米傳感器具有相同的核心基質（包括PS、DTS、C6和氧氣探針PtTFPP），但表面殼層卻各不相同，Si-NPs具有帶負電的二氧化硅表面，PLL-NPs表面是帶正電的PLL殼層，TPP-NPs表面偶聯(lián)TPP基團。通過共聚焦顯微鏡和細胞超薄切片透射電子顯微鏡成像證明Si-NPs、 PLL-NPs和TPP-NPs分別靶向細胞外、細胞內和線粒體。對負載三類納米傳感器的細胞在不同溶氧量環(huán)境中的熒光壽命進行檢測