基于量子點(diǎn)納米熒光材料的腫瘤細(xì)胞靶分子成像及靶向基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究.pdf

1、量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）作為一種新型的納米熒光材料，具備獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)。例如量子點(diǎn)激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，發(fā)射峰窄并且對(duì)稱分布，發(fā)射具有尺寸可調(diào)性，熒光產(chǎn)率高，抗光漂白能力強(qiáng)，量子點(diǎn)表面通過(guò)配體修飾后具有較好的生物相容性。這些優(yōu)異的性質(zhì)特別是光學(xué)特性使量子點(diǎn)在長(zhǎng)時(shí)程細(xì)胞成像、腫瘤細(xì)胞靶分子標(biāo)記以及基因表達(dá)過(guò)程示蹤等領(lǐng)域已取得了很多有意義的成果，在生命科學(xué)領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。本論文的主要工作是研究了殼核型CdSe

2、/ZnS量子點(diǎn)熒光納米材料在腫瘤細(xì)胞靶向性標(biāo)記和作為寡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在基因表達(dá)示蹤方面的應(yīng)用。論文的具體工作如下：
　?。?）將兩種新型的靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的小分子-適配體（GS24）和肽（T7），與CdSe/ZnS QDs偶聯(lián)，制備了QD-GS24，QD-T7兩種具有靶向性的熒光探針并分別用于小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞和人宮頸癌HeLa細(xì)胞的特異性標(biāo)記。熒光成像以及定量流式細(xì)胞分析表明QD-GS24探針能夠特異性識(shí)別小鼠黑色素瘤B16

3、細(xì)胞，QD-T7探針能夠特異性識(shí)別人的宮頸癌HeLa細(xì)胞，并且，在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）的天然配體轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）存在的條件下，兩種探針對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記效率有所增強(qiáng)；透射電子顯微成像（TEM）證實(shí)了QD-GS24，QD-T7熒光探針與相應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合及探針在細(xì)胞內(nèi)的有效轉(zhuǎn)運(yùn)；MTT毒性實(shí)驗(yàn)表明量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性與其表面配體密切相關(guān)，適配體GS24以及靶向肽T7的偶聯(lián)在一定程度上降低了量子點(diǎn)的毒性。該研究結(jié)果對(duì)利用非抗體的靶向分子制備量子點(diǎn)熒光探

4、針具有重要的參考意義。
　?。?）將CdSe/ZnS量子點(diǎn)與鏈霉親和素（SA）偶聯(lián)，利用SA與生物素的多價(jià)結(jié)合能力，設(shè)計(jì)了同時(shí)結(jié)合抗葉酸受體-α（FR-α）的反義寡核苷酸（AS-ODN）和多肽p160的多功能量子點(diǎn)探針QD-(AS-ODN+p160)，并用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AS-ODN的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)體逃逸的實(shí)時(shí)示蹤以及葉酸受體-α（FR-α）表達(dá)變化的研究。共聚焦顯微成像以及流式熒光定量分析表明QD-(AS-ODN+p16

5、0)探針能特異性結(jié)合人乳腺癌MCF-7細(xì)胞；特異性內(nèi)吞阻斷劑以及熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)探針的內(nèi)吞方式主要為受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程；TEM成像顯示了QDs探針細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及其內(nèi)體逃逸過(guò)程；Real-time PCR，Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)從mRNA及蛋白質(zhì)水平研究了QD-(AS-ODN+p160)探針的基因沉默效率。上述結(jié)果表明該多功能量子點(diǎn)探針不但可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)特定細(xì)胞系的靶向基因沉默，同時(shí)也可實(shí)現(xiàn)探針轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的實(shí)時(shí)示蹤。

6、　?。?）基于體系（2），設(shè)計(jì)了一種基于雙受體靶向的量子點(diǎn)-反義核酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體QD-(AS-ODN+GE11+c(RGDfK))，用于增強(qiáng)量子點(diǎn)熒光探針的細(xì)胞攝取效率并提高轉(zhuǎn)染效率。其中，選擇的兩種靶向肽GE11和c(RGDfK)分別能夠特異性結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和整聯(lián)蛋白αvβ3受體，AS-ODN特異性靶向survivinmRNA。Western blot以及免疫熒光實(shí)驗(yàn)表征了HeLa、MDA-MB-231以及MCF-7細(xì)胞

7、系中EGFR和αvβ3受體的表達(dá)豐度。流式細(xì)胞分析以及ICP/MS結(jié)果表明，與兩種單配體修飾的量子點(diǎn)熒光探針QD-(AS-ODN+GE11)和QD-(AS-ODN+c(RGDfK))相比，雙配體修飾的量子點(diǎn)探針QD-(AS-ODN+GE11+c(RGDfK))能夠增強(qiáng)細(xì)胞的攝取效率。特異性內(nèi)吞阻斷劑實(shí)驗(yàn)表明雙配體探針進(jìn)入細(xì)胞的方式主要為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程。Western blot結(jié)果顯示，雙配體系統(tǒng)中靶基因survivin的相對(duì)表達(dá)