基于量子點納米熒光材料的腫瘤細胞靶分子成像及靶向基因轉(zhuǎn)運研究.pdf

1、量子點（quantum dots，QDs）作為一種新型的納米熒光材料，具備獨特的物理化學性質(zhì)。例如量子點激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，發(fā)射峰窄并且對稱分布，發(fā)射具有尺寸可調(diào)性，熒光產(chǎn)率高，抗光漂白能力強，量子點表面通過配體修飾后具有較好的生物相容性。這些優(yōu)異的性質(zhì)特別是光學特性使量子點在長時程細胞成像、腫瘤細胞靶分子標記以及基因表達過程示蹤等領(lǐng)域已取得了很多有意義的成果，在生命科學領(lǐng)域顯示出廣闊的應用前景。本論文的主要工作是研究了殼核型CdSe

2、/ZnS量子點熒光納米材料在腫瘤細胞靶向性標記和作為寡核苷酸轉(zhuǎn)運載體在基因表達示蹤方面的應用。論文的具體工作如下：
　?。?）將兩種新型的靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的小分子-適配體（GS24）和肽（T7），與CdSe/ZnS QDs偶聯(lián)，制備了QD-GS24，QD-T7兩種具有靶向性的熒光探針并分別用于小鼠黑色素瘤B16細胞和人宮頸癌HeLa細胞的特異性標記。熒光成像以及定量流式細胞分析表明QD-GS24探針能夠特異性識別小鼠黑色素瘤B16

3、細胞，QD-T7探針能夠特異性識別人的宮頸癌HeLa細胞，并且，在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）的天然配體轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）存在的條件下，兩種探針對細胞的標記效率有所增強；透射電子顯微成像（TEM）證實了QD-GS24，QD-T7熒光探針與相應細胞的結(jié)合及探針在細胞內(nèi)的有效轉(zhuǎn)運；MTT毒性實驗表明量子點的細胞毒性與其表面配體密切相關(guān)，適配體GS24以及靶向肽T7的偶聯(lián)在一定程度上降低了量子點的毒性。該研究結(jié)果對利用非抗體的靶向分子制備量子點熒光探

4、針具有重要的參考意義。
　?。?）將CdSe/ZnS量子點與鏈霉親和素（SA）偶聯(lián)，利用SA與生物素的多價結(jié)合能力，設(shè)計了同時結(jié)合抗葉酸受體-α（FR-α）的反義寡核苷酸（AS-ODN）和多肽p160的多功能量子點探針QD-(AS-ODN+p160)，并用于乳腺癌MCF-7細胞中AS-ODN的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、內(nèi)體逃逸的實時示蹤以及葉酸受體-α（FR-α）表達變化的研究。共聚焦顯微成像以及流式熒光定量分析表明QD-(AS-ODN+p16

5、0)探針能特異性結(jié)合人乳腺癌MCF-7細胞；特異性內(nèi)吞阻斷劑以及熒光共定位實驗證實探針的內(nèi)吞方式主要為受體介導的內(nèi)吞過程；TEM成像顯示了QDs探針細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及其內(nèi)體逃逸過程；Real-time PCR，Western blot和ELISA實驗從mRNA及蛋白質(zhì)水平研究了QD-(AS-ODN+p160)探針的基因沉默效率。上述結(jié)果表明該多功能量子點探針不但可以實現(xiàn)針對特定細胞系的靶向基因沉默，同時也可實現(xiàn)探針轉(zhuǎn)運過程的實時示蹤。

6、　　（3）基于體系（2），設(shè)計了一種基于雙受體靶向的量子點-反義核酸轉(zhuǎn)運載體QD-(AS-ODN+GE11+c(RGDfK))，用于增強量子點熒光探針的細胞攝取效率并提高轉(zhuǎn)染效率。其中，選擇的兩種靶向肽GE11和c(RGDfK)分別能夠特異性結(jié)合表皮生長因子受體（EGFR）和整聯(lián)蛋白αvβ3受體，AS-ODN特異性靶向survivinmRNA。Western blot以及免疫熒光實驗表征了HeLa、MDA-MB-231以及MCF-7細胞

7、系中EGFR和αvβ3受體的表達豐度。流式細胞分析以及ICP/MS結(jié)果表明，與兩種單配體修飾的量子點熒光探針QD-(AS-ODN+GE11)和QD-(AS-ODN+c(RGDfK))相比，雙配體修飾的量子點探針QD-(AS-ODN+GE11+c(RGDfK))能夠增強細胞的攝取效率。特異性內(nèi)吞阻斷劑實驗表明雙配體探針進入細胞的方式主要為網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞過程。Western blot結(jié)果顯示，雙配體系統(tǒng)中靶基因survivin的相對表達