ZnO溶膠—凝膠電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及精準(zhǔn)甄別肽類興奮劑rhEPO-EPO的實驗研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建超靈敏ZnO溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器，實現(xiàn)肽類興奮劑rhEPO/EPO的快速精準(zhǔn)甄別，并通過系列實驗驗證傳感器甄別檢測rhEPO/EPO的有效性和優(yōu)越性。
　　方法:
　　1.將乙酸鋅溶于無水乙醇中，在超聲波作用下加入氫氧化鋰，制備ZnO溶膠-凝膠溶液。
　　2.利用電極表面化學(xué)修飾技術(shù)，將促紅細(xì)胞生成素受體通過ZnO溶膠-凝膠固定于玻碳電極表面，制備促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極，作為傳感器的識別

2、元件。
　　3.以促紅細(xì)胞生成素受體修飾電極為工作電極、鉑電極為對電極、飽和甘汞電極為參比電極，構(gòu)建成促紅細(xì)胞生成素和/或重組人促紅細(xì)胞生成素電化學(xué)生物傳感器。
　　4.以含有2mmol/LK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的磷酸鹽緩沖液(6.2～9.0，0.05mol/L)為測試底液，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測定，電位掃描范圍為-0.9V～0.7V，電位掃描速率為10～100mv/s，進(jìn)修樣品檢測。
　　5.根據(jù)電

3、位0.14～0.17V處的峰電流和促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液中促紅細(xì)胞生成素的濃度，和/或根據(jù)電位0.06～0.09V處的峰電流和重組人促紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液中rhEPO/EPO的濃度。根據(jù)電流的變化和rhEPO/EPO濃度之間對應(yīng)的關(guān)系來確定生物傳感器的檢測靈敏度及檢測范圍。
　　6.通過系列實驗研究，探索ZnO溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器檢測rhEPO/EPO靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及特異性等傳感器的性能參數(shù)，

4、并對rhEPO治療患者的臨床血清樣本進(jìn)行檢測，并進(jìn)行方法學(xué)比較。
　　7.用三明治型“納米金-ZnO溶膠凝膠-納米金”為生物信號放大系統(tǒng)提高傳感器的檢測靈敏度，探索并優(yōu)化兩次納米金電沉積的最佳時間和納米金的反應(yīng)濃度。
　　結(jié)果:
　　1.當(dāng)ZnO溶膠-凝膠的貯備液與無水乙醇最佳稀釋比為1∶2，ZnO溶膠-凝膠與EPOR體積比為1∶1，電極的溶膠-凝膠的最優(yōu)pH值為9.0時修飾的ZnO溶膠-凝膠EPOR電極在雜交反應(yīng)前后

5、引起的峰電流響應(yīng)變化值最大。
　　2.自主創(chuàng)建的ZnO溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器在電解液的最優(yōu)pH值為7.4，工作電位為-0.3V-0.7V，EPOR濃度為1μg/L，孵育時間為20min時，傳感器雜交反應(yīng)前后引起的電流響應(yīng)變化值最大。
　　3.利用ZnO溶膠-凝膠具有多孔性、高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)惰性及良好的生物兼容性等優(yōu)點(diǎn)，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描測定，由于EPO與rhEPO有等電點(diǎn)的差異，導(dǎo)致EPOR-rhEPO復(fù)合物與EP

6、OR-EPO復(fù)合物的工作電位略有差異，從而將EPO和rhEPO精確甄別。
　　4.隨著EPO/rhEPO濃度從5pg/L到5μg/L變化時，孵育前后所引起的電流響應(yīng)變化值先上升后趨于飽和，以500ng/L為飽和點(diǎn);在5pg/L到500ng/L的EPO/rhEPO濃度范圍內(nèi)，rhEPO的線性回歸方程為:y=1.5737x+14.765，相關(guān)系數(shù)為0.9935;EPO的線性回歸方程為:y=2.1674x+17.691，相關(guān)系數(shù)0.99

7、66。
　　5.EPOR濃度分別是0.10、1.00及10.00μg/L時，天內(nèi)重復(fù)性和天間重復(fù)性的實驗CV值分別為3.99％和7.21％，3.29％和5.15％，6.76％和8.44％。上述三種不同EPOR濃度的天內(nèi)和天間重復(fù)性實驗平均CV值分別是4.39％和6.13％，均小于10％。
　　6.EPOR修飾傳感器4℃避光放置20天、40天、50天后其響應(yīng)電流分別為初始值的95％、82％、77％，變異系數(shù)分別為是2.79％、

8、7.59％、10.50％。傳感器放置60天后的電流響應(yīng)曲線與裸電極的電流響應(yīng)極其相似，傳感器響應(yīng)電流的變化較小。
　　7.傳感器分別檢測EPO、rhEPO和干擾物質(zhì)的實驗結(jié)果表明，在僅含有干擾物質(zhì)的溶液中孵育的電極在孵育前后響應(yīng)電流基本保持不變，而在含有EPO和rhEPO溶液中孵育的電極在孵育前后響應(yīng)電流變化值（△I)分別為8.2μA和9.7μA。
　　8.HAuCl4溶液第一次電沉積時間為60s，第二次電沉積時間為30s，

9、HAuCl4溶液濃度為10mmol/L時，傳感器的響應(yīng)電流變化值最大(△I)。
　　9.通過實驗的優(yōu)化，自主創(chuàng)建的納米金溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器的檢測rhEPO/EPO線性范圍是5pg/L到500ng/L，rhEPO的線性回歸方程為:y=3.7068x+31.796，相關(guān)系數(shù)為0.9912，EPO的線性回歸方程為:y=3.4389x+29.685，相關(guān)系數(shù)0.9925。
　　10.納米金/凝膠受體/納米金修飾電極4℃避光放

10、置10天、30天、50天、70天后其響應(yīng)電流分別為初始值的97.45％、94.33％、83.29％、75.07％，變異系數(shù)分別為是1.83％、2.57％、6.38％、10.48％。傳感器放置80天后韻峰電流變化較小，電流響應(yīng)曲線與陰性電極的電流響應(yīng)極其相似。
　　11.納米金/凝膠受體/納米金生物傳感器的EPOR濃度為0.1.00μg/L時，其天內(nèi)和天間重復(fù)性實驗的CV值分別為2.22％和4.32％;EPOR濃度是1.00μg/L

11、時，天內(nèi)及天間的重復(fù)性實驗CV值分別是2.25％和4.17％;當(dāng)EPOR濃度是100.00μg/L時，其天內(nèi)和天間重復(fù)性實驗的CV值分別為2.40％和3.68％％。
　　12.納米金/凝膠受體/納米金修飾電化學(xué)生物傳感器分別檢測EPO、rhEPO和干擾物質(zhì)的實驗結(jié)果表，而在含有rhEPO和EPO溶液中孵育的電極在孵育前后響應(yīng)電流變化值（△I)分別為29.50μA和27.31μA，在含有rhEPO及干擾物質(zhì)和EPO及干擾物質(zhì)溶液中中

12、孵育的電極在孵育前后響應(yīng)電流變化值（△I)分別為28.63μA和26.42μA，在僅含有干擾物質(zhì)的溶液中孵育的電極在孵育前后響應(yīng)電流基本保持不變。
　　10.根據(jù)傳感器的線性曲線計算rhEPO治療的患者及健康志愿者血清樣本中濃度，將血清樣品濃度倍比稀釋，rhEPO濃度在0.125ng/L～125ng/L的范圍內(nèi)時，其線性回歸方程為:y=3.647x+13.555，相關(guān)系數(shù)為0.9893;EPO濃度在0.073ng/L～73ng/L

13、的范圍內(nèi)時，其線性回歸方程為:y=3.180x+12.380，相關(guān)系數(shù)0.9891。
　　結(jié)論:
　　1.自主創(chuàng)建了rhEPO/EPO精確甄別的電化學(xué)生物傳感器，利用二者只有等電點(diǎn)的細(xì)微差別進(jìn)行檢測，實現(xiàn)rhEPO和EPO的快速精確區(qū)分。
　　2.ZnO溶膠-凝膠電化學(xué)生物傳感器可達(dá)到pg/L級的檢測限靈敏度，與其他檢測方法相比，其檢測靈敏度有了很大提高，并實現(xiàn)了rhEPO/EPO的快速甄別檢測。
　　3.ZnO

14、sol-gel具有很強(qiáng)的吸附能力，并可使電極表面修飾的EPOR保持良好的生物活性，因而確保了傳感器的穩(wěn)定性。
　　4.三種不同EPOR濃度的天間精密性實驗的平均CV值為6.16％，略高于天內(nèi)精密性實驗的平均CV值3.89％，但二者均小于10％。因此，ZnO溶膠-凝膠電化學(xué)傳感器具有良好的重復(fù)性，從而保證了檢測結(jié)果的可靠性。
　　5.自主構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器抗干擾能力強(qiáng)，對EPO和rhEPO具有良好的選擇性，并能對EPO和r