催化水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸菌株的誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、亞氨基二乙酸是一種重要的精細化工中間體，其用途廣泛，其中最主要的用途就是用于生產(chǎn)除草劑草甘膦。目前，亞氨基二乙酸法生產(chǎn)草甘膦是世界上主流的生產(chǎn)方法，因此其需求量將越來越大。而亞氨基二乙酸的生產(chǎn)都是采用化學法生產(chǎn)，包括：氫氰酸法、氯乙酸法、二乙醇胺法、亞氨基二乙腈水解法等主要合成工藝，但是這些方法一般都是污染嚴重、成本高、收率低。利用腈水解酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸具有反應條件溫和、環(huán)境污染小、成本較低等優(yōu)點。而酶法生產(chǎn)亞氨基二乙酸面臨的主要問

2、題是腈水解酶酶活不高，需通過菌種改良或構建基因工程菌的方法以得到具有較高腈水解酶酶活的菌株。本論文以生物合成產(chǎn)物亞氨基二乙酸為研究對象，詳細探討了產(chǎn)物的分離及表征，Alcaligenes foecalis ZJB09133菌株的誘變育種以及高產(chǎn)菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化。
　　 論文首先對亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行提取和表征。利用紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等技術對目標化合物進行結(jié)構鑒定。根據(jù)檢測結(jié)果顯示，亞氨基二乙腈水解得到的產(chǎn)物確為亞氨

3、基二乙酸。在亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化液中加入2％的活性炭，在50℃下攪拌脫色1 h，脫色率達到93.4％。當甲醇加入量是母液的2倍時，純度達到最高的98.3％，收率也基本達到最大。當采用程序降溫的方式結(jié)晶時，得到產(chǎn)品為晶體，晶體形狀為單斜晶體。使用上述方法得到的重結(jié)晶樣品純度達到98.8％，收率為40.2％。
　　 以本實驗室篩選并保藏的Alcaligenes faecalis ZJB09133為出發(fā)菌株，采用UV、UV-LiCl、等離

4、子進行誘變處理，當紫外的照射時間和離子注入量分別為15 s和60×2.3×1013 ions/cm2時，正突變是最高，分別達到20％和22％。在挑取的所有菌落中，最終得到了3株腈水解酶酶活最高的菌株，且經(jīng)過連續(xù)5代的傳代培養(yǎng)，酶活沒有明顯的下降，其中UL144酶活是最高的，達到58.8 U/g DCW，比初始菌株酶活提高了77.1％。
　　 對誘變后的高產(chǎn)菌株Alcaligenes faecalis UL144以單因素法進行培養(yǎng)