2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、α-酮基丁酸是合成多種有用化合物的前體物質(zhì),如L-異亮氨酸、L-高丙氨酸及一些食品添加劑等,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品添加行業(yè)。本文以蘇氨酸高產(chǎn)菌E.coliTHRD為出發(fā)菌株,以代謝工程理論為指導(dǎo),成功構(gòu)建了α-酮基丁酸基因工程菌株。
  首先在THRD基礎(chǔ)上,過(guò)量表達(dá)解除L-異亮氨酸反饋抑制的蘇氨酸脫水酶,使大腸桿菌具備了積累α-酮基丁酸的能力,菌株THRW搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為13.41 g/L,但在發(fā)酵液中檢測(cè)到大量的前體物蘇氨酸和副

2、產(chǎn)物丙酮酸。
  為減弱前體物的外排能力,分別缺失蘇氨酸輸出蛋白R(shí)htA和RhtC。發(fā)現(xiàn)敲除菌的蘇氨酸積累量均大幅下降,但只有RhtA的缺失(菌株THRW-1)有助于提高α-酮基丁酸產(chǎn)量,濃度為14.65 g/L,比THRW提高了9.25%。為阻斷α-酮基丁酸的代謝途徑,在THRW-1基礎(chǔ)上分別敲除基因ilvIH、 ilvBN、tdcE和avtA。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明單獨(dú)缺失基因ilvIH效果最好,菌株THRW-4產(chǎn)量達(dá)到16.44

3、g/L,提高了12.22%。利用7.5 L罐對(duì)THRW-4的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)酵10 h添加IPTG誘導(dǎo),α-酮基丁酸積累量為27.91 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為16.42%,但是發(fā)酵液中仍有24.15 g/L的蘇氨酸存在。
  向大腸桿菌THRW-4中引入甲基蘋果酸途徑,構(gòu)建了α-酮基丁酸雙代謝途徑菌株THRW-4-S1和THRW-4-S2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,兩株菌α-酮基丁酸產(chǎn)量均有提高且丙酮酸濃度明顯降低,證明甲基蘋果酸途徑發(fā)

4、揮了作用。
  考慮到產(chǎn)物抑制作用是導(dǎo)致積累量偏低的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),對(duì)重組菌THRW-4進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化實(shí)驗(yàn),以提升其對(duì)有毒目的產(chǎn)物α-酮基丁酸的耐受能力。突變株的菌體量較馴化前平均提高60%左右,但α-酮基丁酸產(chǎn)量下降70%。嘗試新的解決辦法,利用熱誘導(dǎo)型表達(dá)載體pBV220過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫水酶獲得溫控重組菌株THRB-4(基因型同THRW-4),通過(guò)改變發(fā)酵溫度調(diào)控α-酮基丁酸的合成,該誘導(dǎo)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、利于基因大規(guī)模表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。T

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