小膠質(zhì)細(xì)胞巨型內(nèi)吞泡周圍微管骨架的形態(tài)學(xué)研究.pdf

1、實驗?zāi)康?細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞形態(tài)、運輸細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)、傳遞胞內(nèi)外信號等方面有著非常重要的作用。細(xì)胞皮層處的微絲骨架重排，為細(xì)胞內(nèi)吞提供動力來源;而微管在細(xì)胞內(nèi)部呈放射狀排布，作為胞內(nèi)物質(zhì)運送的軌道。實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在遷移過程中可產(chǎn)生部分大型內(nèi)吞泡。但目前尚未有研究描述微管在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)吞泡形成過程中的定位情況。本課題以ATP誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生大型吞飲泡，對吞飲泡周圍的微管骨架結(jié)構(gòu)進行形態(tài)學(xué)方面的初步研究。實驗方法:培養(yǎng)原代大

2、鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，利用ATPγS誘導(dǎo)產(chǎn)生吞飲泡。使用熒光標(biāo)記葡聚糖（Dextran）對小膠質(zhì)細(xì)胞吞飲泡進行標(biāo)記后，在熒光顯微鏡下進行活細(xì)胞動態(tài)觀察。在ATP誘導(dǎo)吞飲泡產(chǎn)生后，固定細(xì)胞，并利用免疫熒光方法，使用乙?；?、酪氨酸化及α微管蛋白的抗體，標(biāo)記微管骨架。同時，使用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）標(biāo)記纖維狀微絲骨架。隨后，利用激光掃描共聚焦顯微鏡，對巨型吞飲泡的形態(tài)、位置、數(shù)目，周圍環(huán)繞的微管情況以及微絲的分布進行觀察，并通過相

3、關(guān)性分析，對吞飲泡周圍的微管骨架特征進行解析。使用Rab5、Rab7、Rab11的抗體進行免疫熒光染色，分別識別早期內(nèi)吞體、循環(huán)內(nèi)吞體和晚期內(nèi)吞體，以此明確ATPγS引發(fā)原代培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的大型吞飲泡與胞內(nèi)其它已知內(nèi)吞泡之間的關(guān)系。此外，利用超高分辨結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SR-SIM)對微管更細(xì)微的結(jié)構(gòu)進行形態(tài)學(xué)觀察，并用IMARIS軟件對細(xì)胞骨架進行三維重構(gòu)，得到大型吞飲泡周圍微管精細(xì)結(jié)構(gòu)的3D模型。
　　實驗結(jié)果:
　　1.A

4、TPγS處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有大量內(nèi)吞泡形成，這些內(nèi)吞泡能夠被dextran標(biāo)記，因此我們確認(rèn)其為吞飲泡。
　　2.部分巨型吞飲泡周圍有微管結(jié)構(gòu)環(huán)繞。
　　3.對吞飲泡大小、位置的分析結(jié)果顯示:微管更傾向于包繞直徑較大（約為4μm）的吞飲泡。與其它更小、且沒有微管結(jié)構(gòu)包繞的吞飲泡相比，這類巨型吞飲泡更靠近細(xì)胞邊緣。
　　4.巨型吞飲泡周圍環(huán)繞的微管可能與囊泡內(nèi)化過程相關(guān)。
　　實驗結(jié)論:ATPγS處理后的原代培養(yǎng)