大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型BAC載體的構(gòu)建及功能驗證.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、鏈霉菌是微生物中產(chǎn)抗生素種類最多的種屬,目前世界上發(fā)現(xiàn)的5000多種抗生素中,60%以上是由鏈霉菌合成的。作為抗生素的生產(chǎn)菌,鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中有著悠久的歷史,隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,鏈霉菌的基因重組展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。自1980年首次報導(dǎo)鏈霉菌基因克隆以來,鏈霉菌基因工程日益興起。
   載體作為基因工程的重要工具是鏈霉菌基因工程首先遇到的問題。最初科學(xué)家們根據(jù)對少數(shù)幾種鏈霉菌遺傳背景已有的認(rèn)識,建立了一系列由其質(zhì)粒和噬菌

2、體衍生的克隆型載體。后來為了研究某些鏈霉菌基因的功能,需將其基因克隆至大腸桿菌中表達或修飾,有的甚至還需再轉(zhuǎn)移到模式鏈霉菌株(如天藍色鏈霉菌和變鉛青鏈霉菌)中做進一步研究,于是各個實驗室紛紛開始構(gòu)建大腸桿菌-鏈霉菌穿梭型載體。隨著鏈霉菌遺傳工程的進一步發(fā)展,其對載體的要求越來越高,各種功能不同的載體相繼誕生,如鏈霉菌粘粒載體、鏈霉菌基因定域置換型克隆載體等。
   與此同時鏈霉菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也開始建立,主要有PEG介導(dǎo)或脂質(zhì)體協(xié)助的

3、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,以及電擊轉(zhuǎn)化法等。但由于鏈霉菌特殊的結(jié)構(gòu)特點,使得這些轉(zhuǎn)化方法在實際應(yīng)用中遇到不少障礙,效率比較低。1987年,Trien-Cuot等首次闡明大腸桿菌與許多革蘭氏陽性細菌之間可進行質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象,在此基礎(chǔ)上,Mazodier發(fā)展了質(zhì)粒在大腸桿菌和鏈霉菌之間進行接合轉(zhuǎn)移的方法,即向大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體上引入接合轉(zhuǎn)移順式作用元件oriT,將其轉(zhuǎn)化到攜帶RP4質(zhì)粒的大腸桿菌中,載體就在RP4上的反式作用元件tra的誘

4、導(dǎo)下由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移到鏈霉菌中去,這種方法不但易于操作,而且可避開鏈霉菌的甲基化限制作用,提高外源基因的存活率。
   已有報導(dǎo),重組質(zhì)粒在鏈霉菌中不能穩(wěn)定性存在,即使是通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化的也不例外。人們就嘗試構(gòu)建一種可整合至鏈霉菌基因組的載體,主要由Streptomycesambofaciens的質(zhì)粒pSAM2改造和鏈霉菌噬菌體(Ψ)C31衍生得到。其中噬菌體(Ψ)C31的衍生載體因有較高的轉(zhuǎn)化效率而頗受偏愛,如pSET152

5、就是由其整合系統(tǒng)衍生而來,即在載體上引入attP序列(phageattachmentsite)和整合酶基因(int),整合酶可介導(dǎo)attP與鏈霉菌基因組內(nèi)的attB(bacterialattachmentsite)間位點特異性重組,從而將整個載體包括外源基因整合進鏈霉菌基因組中,使外源基因在沒有選擇壓力的情況下在鏈霉菌中穩(wěn)定存在。
   以上問題解決后,鏈霉菌的基因工程一直平穩(wěn)進行著,但隨著研究的深入新的難題不斷涌現(xiàn)。鏈霉菌基因

6、組測序完成后人們發(fā)現(xiàn),在鏈霉菌基因組中與某一天然產(chǎn)物生物合成途徑相關(guān)的基因往往成簇存在,因此都比較大(>60kb),要想完整地克隆這些基因簇就必須要有能裝載大片段的載體。目前應(yīng)用較廣的大片段克隆載體有酵母人工染色體(YAC)和細菌人工染色體(BAC),BAC的插入片段不如YAC長,但其有很多優(yōu)點可彌補YAC的不足,這就使得其應(yīng)用和發(fā)展遠遠超過了YAC?,F(xiàn)有的BAC載體多以大腸桿菌為宿主,缺乏在鏈霉菌中進行基因操作的元件,使得其在鏈霉菌基

7、因工程中的應(yīng)用受到很大限制。
   本實驗從原始載體pBeloBAC11出發(fā),將其上的氯霉素抗性基因替換為用于接合轉(zhuǎn)移(oriT)、定點整合(attp-int)和安普霉素抗性篩選(Am)的oriT-attp-int-Am的DNA片段(稱之為替換盒),為了精確替換,實驗采用了Red同源重組的方法,即將一段兩端與染色體(或載體)特定靶序列兩翼各有40~60bp同源序列的PCR線性DNA片段導(dǎo)入宿主菌細胞,利用λ噬菌體Red重組酶使該

8、線性片段與靶序列發(fā)生同源重組,線性DNA片段即可替換靶序列,得到的質(zhì)粒命名為pBTIBAC1。其中Red重組酶由輔助質(zhì)粒pKD46攜帶,其表達受L-阿拉伯糖誘導(dǎo),且具有溫度敏感型的復(fù)制子,在溫度高于37℃時,自動從宿主茵中清除。
   為便于以后使用,合成新的多克隆位點(MCS),其上包含EcoRⅠ、AvrⅡ、PacⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ、BamHⅠ酶切位點,通過EcoRⅠ和BamHⅠ酶切插入到pBTIBAC1的相應(yīng)位點,得到最

9、終載體pBTIBAC11。
   接下來是對pBTIBAC11功能的驗證。先檢驗其是否具有接合轉(zhuǎn)移和整合的功能,在其多克隆位點反向插入鏈霉菌的組成型啟動子ermEp*和綠色熒光蛋白基因(gfp),得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ET12567(pUZ8002)(接合轉(zhuǎn)移供體菌),再通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至變鉛青鏈霉菌中,通過多標(biāo)記微孔板檢測儀(酶標(biāo)儀)和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察,結(jié)果都顯示了綠色熒光蛋白的表達,說明載體pBTIBAC11具有預(yù)期接合轉(zhuǎn)移

10、和整合的功能。
   然后檢測其裝載量。為了獲得足夠大的插入片段,采用了構(gòu)建基因組文庫的方法,將變鉛青鏈霉菌TK24(Streptomyces'lividansTK24)的基因組做BamHⅠ的部分酶切,然后進行脈沖場凝膠電泳,切取48.5-194.0kb的膠條進行第二次脈沖場凝膠電泳,電洗脫回收條帶較亮部分,連入pBTIBAC11的相應(yīng)位點,電轉(zhuǎn)至DH10B中,對通過安普抗性篩選得到的轉(zhuǎn)化子克隆提質(zhì)粒,用EcoRⅠ和BamHⅠ短

11、暫酶切鑒定插入片段的大小,平均都在100kb左右。
   綜上,本實驗從原始載體pBeloBAC11出發(fā):①引入oriT序列,方便其由大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移至鏈霉菌中,克服了鏈霉菌難于轉(zhuǎn)化和鏈霉菌嚴(yán)格限制系統(tǒng)的問題;②加入attp-int元件,可使外源基因(簇)連同載體一起整合至鏈霉菌基因組中,提高了外源基因(簇)的穩(wěn)定性;③替換了氯霉素抗性為安普霉素抗性,可用于載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和鏈霉菌的特異性篩選標(biāo)記;④保留了BAC載體原有的功能元

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