大腸桿菌高產(chǎn)色氨酸菌株的構(gòu)建.pdf

1、色氨酸是一種重要的營養(yǎng)必需氨基酸。色氨酸主要存在三種異構(gòu)體:L型，D型，DL型。L-色氨酸是人和動(dòng)物體所必需的8種氨基酸之一，由于L-色氨酸只能夠在綠色植物和微生物體內(nèi)合成，人和動(dòng)物體內(nèi)的色氨酸攝取只能是從外界中的食物來獲取。在這三種構(gòu)型的色氨酸中，動(dòng)物體內(nèi)幾乎不含有D-色氨酸，而且D-色氨酸也沒有任何代謝作用，不過也沒有毒性。所以目前有關(guān)色氨酸的研究主要是針對L-色氨酸的研究進(jìn)展來進(jìn)行的。隨著色氨酸研究的越來越深入，其應(yīng)用也逐步涉及到

2、醫(yī)藥，食品，飼料添加劑等各個(gè)方面。
　　本研究以現(xiàn)有的大腸桿菌芳香族氨基酸代謝通路為理論基礎(chǔ)基礎(chǔ)，引入Red重組酶系統(tǒng)敲除大腸桿菌基因組上trpR基因，目的是解除了基因組上大腸桿菌內(nèi)色氨酸合成過程中的反饋?zhàn)瓒簦{(diào)整色氨酸合成限制性步驟基因拷貝數(shù)量等方法，改造色氨酸合成過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期提高色氨酸的發(fā)酵水平。另一方面，將通過改造生產(chǎn)菌株底盤細(xì)菌色氨酸代謝通路入手，敲除底盤細(xì)菌色氨酸代謝通路的基因，重新構(gòu)建表達(dá)色氨酸操縱子基因的質(zhì)

3、粒，在大腸桿菌體內(nèi)高效表達(dá)。
　　本文主要內(nèi)容如下:
　　(1) Red重組法構(gòu)建trpR基因的缺失突變株。
　　色氨酸在大腸桿菌內(nèi)的代謝過程的關(guān)鍵步驟在于中心途徑之后的共同途徑和分支途徑。分支途徑中所需要的酶主要由色氨酸操縱子基因來編碼合成，其中trpE、trpD編碼鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)，此酶的活性主要受到反饋抑制的調(diào)控。大腸桿菌中，鄰氨基苯甲酸合成酶是色氨酸合成過程中的關(guān)鍵酶之一，對活性的調(diào)控主要由trpR蛋

4、白實(shí)現(xiàn)，當(dāng)trpR蛋白表達(dá)并與色氨酸結(jié)合后，會(huì)轉(zhuǎn)錄阻遏色氨酸操縱子基因。所以理論上講，如果敲除大腸桿菌基因組上的trpR基因，這樣就能夠解除色氨酸合成過程中的反饋抑制，從而達(dá)到提高色氨酸產(chǎn)量的目的。
　　(2)重新改造現(xiàn)有的質(zhì)粒mc33。
　　現(xiàn)有質(zhì)粒已將色氨酸操縱子trpABCDE串聯(lián)表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建重組質(zhì)粒pSU18-trp operon和pUC19-serA/aroG，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌，搖瓶發(fā)酵檢測色氨酸發(fā)

5、酵水平，15h左右最高產(chǎn)酸量可達(dá)0.1mg/L。
　　(3)建立合適的HPLC測定發(fā)酵液中L-色氨酸的方法。
　　測定L-色氨酸的傳統(tǒng)方法主要有紙層析法、薄層分析法、比色法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀測定法等。在實(shí)驗(yàn)室研究中最常用的方法主要是對二氨基苯甲醛法和柱前衍生HPLC法。但是這兩種方法都有其局限性和不足之處。主要是因?yàn)榇藘煞N方法都需要濃硫酸作為顯色劑，而且操作步驟復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)性較大。另外其測量精度也不如HPLC法

6、。所以目前在L-色氨酸含量測定研究中人們已經(jīng)逐步采用HPLC法來替代這兩種方法。因?yàn)樵谧贤夤鈪^(qū)278nm處L-色氨酸有特異性光吸收，HPLC法測定色氨酸含量的理論依據(jù)是利用光電二極管陣列(DAD)檢測器來檢測在此波長下吸收峰的面積變化來確定L-色氨酸的含量。本次研究采取的HPLC運(yùn)行條件:以SunFireTMC18柱(5μm，150mm×4.6mm)為分離柱，流動(dòng)相比例是V(0.03％KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10，流量為1