利用紅色熒光蛋白構(gòu)建直觀判斷重組子的大腸桿菌表達(dá)載體.pdf

1、應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時，為了能夠方便、直觀、快速高效地選擇出含有目的基因的重組克隆，選擇紅色熒光蛋白作為報告基因，目標(biāo)構(gòu)建出在轉(zhuǎn)化次日就能通過菌體顏色的明顯變化，判斷出重組克隆的新型載體:即未插入外源基因的菌落顯示紅色，插入外源基因的菌落不顯示紅色。本文通過研究不同類型的啟動子、紅色熒光蛋白DNA序列、誘導(dǎo)劑影響以及紅色熒光蛋白氨基酸序列幾個方面，優(yōu)化得到最佳的表達(dá)載體。
　　 首先采用T7、lac和tac啟動子表達(dá)系統(tǒng)，把

2、紅色熒光蛋白(DsRed2)基因插入到各種載體質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌。結(jié)果表明，重組菌落可以顯示紅色，但需要數(shù)天時間，三種啟動子無明顯差別。
　　 通過對DsRed2基因序列的分析，發(fā)現(xiàn)該基因存在兩個在大腸桿菌中表達(dá)的不利因素:(1)GC含量高且分布不均勻，易于形成二級結(jié)構(gòu)，不利于DNA-RNA-蛋白質(zhì)的遺傳信息的有效流動;(2)RFP中有12個脯氨酸，其密碼子全部為CCC，這是大腸桿菌使用頻率最低的密碼子。由于這

3、兩個缺點都不利于RFP基因在大腸桿菌中的高水平表達(dá)，通過全基因合成方法，實現(xiàn)了將(DsRed2)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，通過提高RFP的表達(dá)水平來加快含有RFP基因的重組菌落顯示紅色的速度。結(jié)果表明含有全基因合成RFP的重組菌落顯色速度有所提高。
　　 接著研究了利用誘導(dǎo)劑加速菌落顏色變化的實驗，通過添加不同類型和濃度的誘導(dǎo)劑，發(fā)現(xiàn)半乳糖可以加快RFP菌落變色速度，縮短變色時間。
　　 最后通過對RFP基因中氨基酸序列的分析，

4、發(fā)現(xiàn)某些位點的氨基酸突變，有利于加快紅色熒光蛋白結(jié)構(gòu)的成熟速度。所以對DsRed2基因進(jìn)行了7個氨基酸的定點突變:S4T、N6D、V7D、H41T、N42Q、V44A、A145P。實驗結(jié)果表明，帶有7點突變RFP基因的重組菌落仍然不能在預(yù)期的轉(zhuǎn)化次日顯示紅色。當(dāng)進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)A145P這一位點的突變，導(dǎo)致RFP蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生重要改變，不利于紅色熒光蛋白正確結(jié)構(gòu)的呈現(xiàn)。最后僅對有利于RFP快速成熟的H41T、N42Q、V44A三個位點突變