應用于FGF21的一種蛋白制劑的固相PEG修飾技術.pdf

1、目的:
　　FGF21作為一種內分泌激素具有潛在治療代謝性疾病的作用，例如2型糖尿病和肥胖。FGF21作為一種治療藥物由于其低穩(wěn)定性，易于聚合的特性以及易受體內蛋白水解等原因而受到限制。通過定點誘變技術引入半胱氨酸殘基得到重組人FGF21突變體，并開發(fā)了一種固相鎳親和聚乙二醇化戰(zhàn)略。由此設計得到:固定化的蛋白的表面暴露半胱氨酸殘基被用作一個平臺，有效地和選擇性地與PEG-馬來酰亞胺結合。這種聚乙二醇化的FGF21結合物保留了其生物

2、學功能，并且表現(xiàn)出半衰期增加并超過211.3分鐘。通過FGF21作為原型，我們提供了一個“廣義的”固相的方法有效地增加蛋白質制劑的血清半衰期。
　　方法:
　?。ㄒ唬┍磉_和純化Sumo-FGF21突變體
　　我們將重組人FGF21進行點突變，構建3個突變體。利用QuikChange位點定向誘變試劑盒將3個突變體質粒誘導入表達載體。接著通過PCR融合技術，擴增的PCR產物（包括突變FGF21基因與SUMO）用NdeⅠ和X

3、hoⅠ進行酶切，再將酶切得到的片段與pET3c載體酶切得到的相應片段進行連接，得到pET3c-SUMO-FGF21融合質粒，再將這個融合質粒轉染入BL21(DE3)感受態(tài)細胞，再進行培養(yǎng)表達得到所需要的蛋白。
　　收集的菌體經(jīng)過離心收集和破碎處理。先經(jīng)過pharose FF柱純化，再用Ni-NTA樹脂進一步純化。最終所需的SOMO-FGF21突變蛋白進一步通過SDS-PAGE電泳和WB技術驗證，并通過BCA測得蛋白濃度。
　

4、?。ǘ〧GF21的固相PEG修飾以及純化
　　三個步驟:(1)將SUMO-FGF21溶解于HEPES緩沖液中，加入并結合到Ni-NTA親和層析柱中。(2)在4℃條件下，將mPEG-MAL的溶液以0.01 mL/分鐘流速在柱中循環(huán)，確保其共價結合到FGF21G71C突變體第71位的半胱氨酸上。最后，用平衡緩沖液洗脫未反應的mPEG-MAL。(3)用添加了咪唑的HEPES緩沖液洗脫反應后的復合物。收集洗脫液，并通過電泳確定反應混合物

5、。最后進行脫鹽濃縮處理，為了確定定點PEG特異性修飾的最佳條件，我們研究了不同的PEG/蛋白反應摩爾比與反應時間的變化對結果的影響。對稀釋液進行Sumo酶切處理，接著將復合物加載到Q-Sepharose Fast Flow柱上進行剃度洗脫，收集各洗脫峰對應的洗脫液，用電泳進行分析。最后將得到的純化蛋白進行除鹽濃縮，再用純化水稀釋后在4℃保存。
　?。ㄈ┲炯毎只疤俏諏嶒?br>　　將3T3-L1前脂肪肝細胞以25×103鋪

6、板到24孔板中，并在鋪板兩天后進行誘導，更換誘導液Ⅰ兩天后，跟換成誘導液Ⅱ再培養(yǎng)2天。在這之后繼續(xù)用正常的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)9-20天（每隔一天換液）。在7天后就能觀察到脂滴的積累＞95％的細胞數(shù)，分化7-10天的細胞用于更一步的實驗。葡萄糖吸收實驗時，先將分化后的細胞饑餓處理，再用FGF21WT，F(xiàn)GF21突變體(FGF21 A59C，F(xiàn)GF21G71C和FGF21A59C，G71C)，以及PEG修飾的FGF21突變體(PEG-FGF21

7、G71C)作用24h，接著用KRP緩沖液洗兩次，再用葡萄糖試劑盒進行糖吸收檢測。
　?。ㄋ模┵|譜和圓二色光譜分析
　　質譜的分析是通過使用具有氮激光的Applied Biosystems VoyagerSystem DE PRO MALDI-TOF質譜儀。FGF21WT，F(xiàn)GF21G71C和固相修飾的PEG-FGF21(PEG-FGF21G71C)的二級結構是通過使用圓形二色光(CD)分光偏正器獲得。質譜的檢測進行三次平行對

8、照實驗，CD光譜儀先用緩沖液進行校準。
　?。ㄎ澹┕滔嘈揎椀腜EG-FGF21 G71C的生物穩(wěn)定性和藥代動力學評價為了確定在生理相關的溫度條件下FGF21的定點突變體和PEG固相修飾后的生物穩(wěn)定性，我們將FGF21WT，F(xiàn)GF21 G71C和PEG-FGF21 G71C相同的濃度在37℃條件下在小鼠血清中孵育相同的時間，然后再將樣品進行葡萄糖吸收分析和以及通過人FGF21免疫測定ELISA進行定量。更進一步評價蛋白的熱穩(wěn)定性，我

9、們將之前所述的蛋白加入到PBS緩沖液中在37℃條件下孵育不同的時間點，再通過葡萄糖吸收實驗測定不同時間點蛋白的活性。
　　非PEG化和PEG化蛋白的體內半衰期是通過單次靜脈內(Ⅳ)注射FGF21WT， FGF21A59C,FGF21G71C, FGF21A59C,G71C和PEG-FGF21 G71C到成年SD大鼠中而測得，通過人FGF21免疫ELISA試劑盒測得大鼠血中蛋白的動態(tài)變化。通過藥物和統(tǒng)計軟件來確定藥代動力學參數(shù)。通過

10、t1/2=0.693/Ke公式計算得到血漿半衰期。并且各組織中蛋白的含量也通過人FGF21免疫ELISA試劑盒測得。
　?。?PEG-FGF21G71C在OB/OB小鼠中的功能性評價
　　分別將成年(11-12 Weeks)肥胖Lepob/obC57BL/6(OB/OB)小鼠隨機分為4組，每組6只，前三組分別用FGF21WT，F(xiàn)GF21G71C，和PEG-FGF21 G71C處治療，最后一組用0.9％生理鹽水作為肥胖對照

11、組。6只正常對照C57BL/6小鼠(8-12 Weeks)用0.9％生理鹽水處理作為正常對照組。我們連續(xù)7天對動物每日進行一次皮下給藥，用于評價其慢性治療作用。治療開始后，我們對血糖，體重和食物消耗量進行了監(jiān)測。在規(guī)定時間進行尾靜脈取血，并檢測血糖，甘油三酯的變化水平，比較FGF21和突變體之間的作用強弱以及PEG化的FGF21突變體是否具有長效抗糖尿病作用。之后，取得各組小鼠肝臟，再進行HE染色和熒光免疫組化分析。
　　（七）W

12、B分析
　　將分化好的3T3-L1細胞饑餓處理，再加入FGF21WT，F(xiàn)GF21G71C和PEG-FGF21 G71C刺激15分鐘，再裂解收集樣品。通過檢測磷酸化的AKT指標來比較胰島素信號通路。另外，對給藥(FGF21WT，F(xiàn)GF21G71C，orPEG-FGF21G71C)7天后的各組小鼠的肝臟組織也進行裂解，提取蛋白，通過檢測磷酸化的AKT指標來比較胰島素信號通路。通過與對照組對比，比較各給藥藥組作用強弱。
　　結果:

13、
　?。ㄒ唬┑玫酵蛔凅w純蛋白及活性結果
　　三種FGF21變種（FGF21A59C，F(xiàn)GF21G71C和FGF21A59C, G71C）成功表達并純化。通過融合SUMO與人FGF21，顯著增強人FGF21在大腸桿菌中的可溶性表達水平。因此，我們設計的FGF21融合蛋白能夠進行大規(guī)模表達和純化。之后我們通過分化的3T3-L1細胞進行糖吸收實驗，驗證各突變體蛋白的活性。在體外活性中，F(xiàn)GF21G71C突變體比其它兩種突變體（FG

14、F21 A59C和FGF21 A59C, G71C）活性更強，并且與FGF21 WT相當。我們的體內研究表明，F(xiàn)GF21G71C比FGF21WT和另外兩個變體(FGF21 A59C和FGF21 A59C, G71C)更穩(wěn)定。因此，我們所選擇的FGF21G71C突變體用于之后的實驗。
　?。ǘ┩蛔凅w的固相PEG修飾和純化結果
　　結果顯示，在4℃反應12小時，摩爾比為12/1時得到產率最優(yōu)的單PEG修飾產物。通過SDS-PA

15、GE電泳和掃描光密度分析結果得到，在最佳條件下，48.9％的SUMO-FGF21G71C成功的被PEG化。接著將修飾好的PEG-SUMO-FGF21G71C進行稀釋并通過SUMO蛋白酶切割。最終通過Q柱進行純化，成功得到較純的PEG-FGF21G71C蛋白。通過MALDI-TOF質譜(MALDI-TOF-MS)分析，確保FGF21 G71C是否為單PEG修飾。我們的數(shù)據(jù)結果表明，PEG化的FGF21G71C具有的分子量為39.3 kDa

16、，這表明，單個20kDa的PEG分子被綴合到非PEG化的FGF21G71C上。
　　（三）聚乙二醇化的FGF21 G71C的結構和生化活性結果圓二色譜結果表明，突變體與野生型的FGF21的二級結構只存在細微的差別，這說明定點突變及固相PEG修飾并不改變野生型FGF21的結構。此外，葡萄糖攝取實驗結果表明，F(xiàn)GF21G71C和聚乙二醇化FGF21G71C的生物活性均與FGF21WT完全一致。細胞通路的激活的分析也表明，F(xiàn)GF21突變

17、體也能激活FGF21信號傳導通路。
　?。ㄋ模┕滔嘈揎椀腜EG-FGF21G71C生物穩(wěn)定性及藥代動力學結果FGF21WT，F(xiàn)GF21G71C和PEGFGF21G71C的生物穩(wěn)定性比較是模擬體內生理環(huán)境，通過在37℃，在小鼠血清中孵育不同的時間點來比較。賦予過的每個時間點的蛋白都經(jīng)過糖吸收實驗，結果表明在孵育了120 h后，F(xiàn)GF21 WT和FGF21G71C保留原始細胞34.3％和45.1％的生物活性，而PEG化的FGF21 G

18、71C保留了60.6％的活性。
　　ELISA數(shù)據(jù)表明，PEG-FGF21G71C比FGF21G71C和FGF21 WT降解的速度慢，與活性結果一致。為了更具體的測定蛋白的熱穩(wěn)定性，我們將FGF21 WT，F(xiàn)GF21G71C和PEG-FGF21G71C在37℃PBS中孵育不同時間點。結果與血清中所得的結果一致。所有的這些結果表明，定點突變和PEG修飾都能生物穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性增加，PEG修飾相比較于FGF21G71C更顯著。通過人免

19、疫FGF21ELISA試劑盒測定SD大鼠單劑量給藥后體內半衰期，結果表明野生型FGF21的半衰期為23.7分鐘，突變體FGF21G71C的半衰期為59.8分鐘，而固相修飾的PEG-FGF21G71C的半衰期為211.3分鐘，并且PEG化的突變體更能在主要器官中積累，例如肝臟，胰腺，和皮下脂肪等。
　　（五）PEG-FGF21G71C在ob/ob小鼠中抗糖尿病作用結果
　　通過每日皮下注射相同劑量的FGF21 WT，F(xiàn)GF21

20、 G71C和PEG-FGF21G71C，給藥3天后所有的突變體都表現(xiàn)出顯著的降低血糖和甘油三酯水平的作用。在7天給藥結束后，血糖和甘油三酯水平逐漸恢復到給藥前水平，但是FGF21G71C所顯示的降糖作用相比FGF21 WT稍好。更重要的是，PEG-FGF21G71C具有持續(xù)降息血糖和甘油三酯的作用，甚至在結束給藥14天后仍然有作用。我們還觀察到在給藥期間小鼠的體重明顯下降。對OB/OB小鼠的肝組織切片的觀察中發(fā)現(xiàn)，存在廣泛的微型或大型空

21、泡。但是用PEG-FGF21G71C治療后的肝臟組織切片中的肝細胞空泡顯著減少，甚至是7天治療結束后然有效果。為了證明PEG化FGF21G71C在胰島素敏感的狀態(tài)下的代謝作用，我們檢測了肝臟組織的磷酸化AKT水平。結果顯示，PEG化FGF21G71C作用后，P-AKT的表達水平增加。
　?。㏄EG-FGF21G71C減少OB/OB小鼠的肝臟中間質性巨噬細胞浸潤
　　因為T2D患者的許多組織（如肝，腎和脂肪組織）都顯示出的

22、促炎性應答，所以我們研究了PEG-FGF21G71C對ob/ob小鼠的肝巨噬細胞浸潤的效果。CD68陽性因子的表達是作為降低胰島素敏感性的標志，并作為受影響組織的炎癥狀態(tài)。CD68在多種組織中表達，包括肝中的巨噬細胞。OB/OB鼠中存在大量的CD68陽性巨噬細胞和高表達的CD68基因。使用FGF21WT突變體治療后，肝中CD68陽性巨噬細胞和CD68基因的表達都明顯減少。與FGF21WT相比，F(xiàn)GF21G71C，PEG-FGF21 G7

23、1C表現(xiàn)出更強的抑制效果。這種效果即使在7天給藥結束后仍然能觀察到，體現(xiàn)了其長效激素共軛作用。
　　結論:
　?。ㄒ唬┩ㄟ^定點突變技術得到3種FGF21突變體，通過固相PEG修飾技術得到PEG-FGF21 G71C
　　（二）生物活性研究表明FGF21G71C，PEG-FGF21G71C具有與FGF21WT一致的活性，且保持了激活FGF21下游信號通路能力。熱穩(wěn)定性表明FGF21G71C，PEG-FGF21G71C較F