四溴雙酚A(TBBPA)對櫛孔扇貝毒性效應與差異基因篩選的研究.pdf

1、為了防止火災的發(fā)生,溴系阻燃劑(Brominated flame retardants)被廣泛的應用于塑料、電子產(chǎn)品等中去。最廣泛應用的溴系阻燃劑包括多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl esters)、六溴環(huán)十二烷(hexabromocyclodecane)和四溴雙酚A(tetrabisphenol A),其中四溴雙酚A是市場上應用最廣泛的溴系阻燃劑,由于它的生物累積性以及遷移性對環(huán)境造成了持久的危害。據(jù)報道TB

2、BPA在各種環(huán)境介質(zhì)中普遍存在,比如水,空氣,土壤甚至人體中。TBBPA對水生生物具有很高的急性毒性效應,但關(guān)于TBBPA對水生生物的亞慢性毒性效應的研究很少,分子和基因表達分析的研究更是少之又少。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國沿海重要的養(yǎng)殖貝類,本文以櫛孔扇貝作為研究對象,分別從酶學水平和分子水平研究了TBBPA對櫛孔扇貝的毒性效應,并運用抑制消減雜交技術(shù)篩選出櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下的差異表達基因,為后續(xù)基因芯片

3、的研究提供了理論基礎。
　　1四溴雙酚A對櫛孔扇貝毒性效應的研究
　　本文研究了TBBPA對櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的毒性作用,實驗選取櫛孔扇貝幼貝、成貝殼高分別為(1.0±0.15)cm、(4.6±0.2)cm。設置櫛孔扇貝幼貝、成貝急性毒性實驗梯度:2、2.8、3.92、5.488、7.6832mg/L和1、1.4、1.96、2.744、3.8146mg/L(間隔系數(shù)為1.4),櫛孔扇貝成貝亞慢性毒性實

4、驗梯度:50、100和200μg/L,且均以自然海水作為對照組。結(jié)果顯示:櫛孔扇貝幼貝和成貝在24h、48h、72h、96h的LC50分別為5.924、4.169、3.095、2.614mg/L和2.458、1.657、1.502、1.342mg/L。TBBPA對櫛孔扇貝組織AHH、GST、SOD活力和.DNA損傷(F值表示)影響顯著(P＜0.05),而對照組無明顯變化。兩組織各處理組AHH、SOD活力均被顯著抑制,且在實驗時間內(nèi)呈峰值

5、變化,穩(wěn)定后皆顯著低于對照組水平(P＜0.05);兩組織各處理組GST活力在50μg/L處理組被顯著誘導而在100、200μg/L處理組均被顯著抑制,且分別在9d、6d內(nèi)呈峰值變化,穩(wěn)定后顯著高于或低于對照組水平(P＜0.05);鰓組織中50μg/L處理組F值在3d內(nèi)呈峰值變化,于1d達到最大值,并于3d恢復至對照組水平(P＞0.05);100、200μg/L處理組F值在9d內(nèi)成峰值變化,并分別于3d、1d達到最小值,并于9d后恢復至對

6、照組水平(P＞0.05)。消化盲囊組織中各處理組F值在15d內(nèi)呈峰值變化,并均于6d達到最大值,15d后恢復至對照組水平(P＞0.05)。由此可見,櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下急性毒性效應明顯,組織解毒代謝酶活力表現(xiàn)出明顯的時間、劑量效應性,鰓絲、消化盲囊AHH、GST和SOD活力可作為櫛孔扇貝TBBPA污染評價的潛在生物標志物。
　　2櫛孔扇貝芳烴受體轉(zhuǎn)運蛋白(ARNT)基因的克隆與序列分析
　　本研究通過相近物種的ARNT

7、氨基酸序列比對,設計兼并引物釣取核心片段及運用Race法擴全長。結(jié)果得到櫛孔扇貝ARNT序列1268bp,包括1020bp的ORF,起始密碼子ATG,終止密碼子TAG,該序列共編碼340個氨基酸,等電點(pI)為7.868,分子量37.70845kDa。將櫛孔扇貝的氨基酸序列通過多重序列比對后發(fā)現(xiàn)與其他物種有較好的保守性,同源性較高。組織特異性分析ARNT基因在鰓、消化盲囊、閉殼肌、足和外套膜中均有分布,其中鰓組織中的表達量相對最高,而

8、在外套膜表達量相對最低。
　　3櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下基因表達分析的研究
　　本研究運用抑制消減雜交技術(shù)篩選TBBPA脅迫下的差異基因。正反向共測序316個克隆,除去序列較短以及測序失敗的樣品,共得到247個EST序列,其中正向消減文庫203個,反向消減文庫44個,文庫中EST序列與已知基因的匹配率達到78.16％。運用Blast2go軟件對序列進行分類,反向文庫包括:細胞分化(2％),細胞過程(31％),死亡(5％),

9、代謝過程(32％),生物周期(9％),定位(7％),應激(14％);正向文庫包括:細胞過程(23％),免疫過程(1％),死亡(5％),應激(3％),細胞組成(3％),新陳代謝(19％),細胞凋亡(1％),發(fā)育過程(5％),生命周期(10％),繁殖(1％),細胞組成(5％),多細胞機體過程(1％),定位(13％),信號轉(zhuǎn)導(2％)。GenBank序列號為JK729464-JK729642。運用熒光定量技術(shù)對差異基因進行驗證并進一步對部分基