四溴雙酚A(TBBPA)對(duì)櫛孔扇貝毒性效應(yīng)與差異基因篩選的研究.pdf

1、為了防止火災(zāi)的發(fā)生,溴系阻燃劑(Brominated flame retardants)被廣泛的應(yīng)用于塑料、電子產(chǎn)品等中去。最廣泛應(yīng)用的溴系阻燃劑包括多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl esters)、六溴環(huán)十二烷(hexabromocyclodecane)和四溴雙酚A(tetrabisphenol A),其中四溴雙酚A是市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的溴系阻燃劑,由于它的生物累積性以及遷移性對(duì)環(huán)境造成了持久的危害。據(jù)報(bào)道TB

2、BPA在各種環(huán)境介質(zhì)中普遍存在,比如水,空氣,土壤甚至人體中。TBBPA對(duì)水生生物具有很高的急性毒性效應(yīng),但關(guān)于TBBPA對(duì)水生生物的亞慢性毒性效應(yīng)的研究很少,分子和基因表達(dá)分析的研究更是少之又少。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國(guó)沿海重要的養(yǎng)殖貝類(lèi),本文以櫛孔扇貝作為研究對(duì)象,分別從酶學(xué)水平和分子水平研究了TBBPA對(duì)櫛孔扇貝的毒性效應(yīng),并運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)篩選出櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下的差異表達(dá)基因,為后續(xù)基因芯片

3、的研究提供了理論基礎(chǔ)。
　　1四溴雙酚A對(duì)櫛孔扇貝毒性效應(yīng)的研究
　　本文研究了TBBPA對(duì)櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的毒性作用,實(shí)驗(yàn)選取櫛孔扇貝幼貝、成貝殼高分別為(1.0±0.15)cm、(4.6±0.2)cm。設(shè)置櫛孔扇貝幼貝、成貝急性毒性實(shí)驗(yàn)梯度:2、2.8、3.92、5.488、7.6832mg/L和1、1.4、1.96、2.744、3.8146mg/L(間隔系數(shù)為1.4),櫛孔扇貝成貝亞慢性毒性實(shí)

4、驗(yàn)梯度:50、100和200μg/L,且均以自然海水作為對(duì)照組。結(jié)果顯示:櫛孔扇貝幼貝和成貝在24h、48h、72h、96h的LC50分別為5.924、4.169、3.095、2.614mg/L和2.458、1.657、1.502、1.342mg/L。TBBPA對(duì)櫛孔扇貝組織AHH、GST、SOD活力和.DNA損傷(F值表示)影響顯著(P＜0.05),而對(duì)照組無(wú)明顯變化。兩組織各處理組AHH、SOD活力均被顯著抑制,且在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈峰值

5、變化,穩(wěn)定后皆顯著低于對(duì)照組水平(P＜0.05);兩組織各處理組GST活力在50μg/L處理組被顯著誘導(dǎo)而在100、200μg/L處理組均被顯著抑制,且分別在9d、6d內(nèi)呈峰值變化,穩(wěn)定后顯著高于或低于對(duì)照組水平(P＜0.05);鰓組織中50μg/L處理組F值在3d內(nèi)呈峰值變化,于1d達(dá)到最大值,并于3d恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05);100、200μg/L處理組F值在9d內(nèi)成峰值變化,并分別于3d、1d達(dá)到最小值,并于9d后恢復(fù)至對(duì)

6、照組水平(P＞0.05)。消化盲囊組織中各處理組F值在15d內(nèi)呈峰值變化,并均于6d達(dá)到最大值,15d后恢復(fù)至對(duì)照組水平(P＞0.05)。由此可見(jiàn),櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下急性毒性效應(yīng)明顯,組織解毒代謝酶活力表現(xiàn)出明顯的時(shí)間、劑量效應(yīng)性,鰓絲、消化盲囊AHH、GST和SOD活力可作為櫛孔扇貝TBBPA污染評(píng)價(jià)的潛在生物標(biāo)志物。
　　2櫛孔扇貝芳烴受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT)基因的克隆與序列分析
　　本研究通過(guò)相近物種的ARNT

7、氨基酸序列比對(duì),設(shè)計(jì)兼并引物釣取核心片段及運(yùn)用Race法擴(kuò)全長(zhǎng)。結(jié)果得到櫛孔扇貝ARNT序列1268bp,包括1020bp的ORF,起始密碼子ATG,終止密碼子TAG,該序列共編碼340個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)(pI)為7.868,分子量37.70845kDa。將櫛孔扇貝的氨基酸序列通過(guò)多重序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)與其他物種有較好的保守性,同源性較高。組織特異性分析ARNT基因在鰓、消化盲囊、閉殼肌、足和外套膜中均有分布,其中鰓組織中的表達(dá)量相對(duì)最高,而

8、在外套膜表達(dá)量相對(duì)最低。
　　3櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下基因表達(dá)分析的研究
　　本研究運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)篩選TBBPA脅迫下的差異基因。正反向共測(cè)序316個(gè)克隆,除去序列較短以及測(cè)序失敗的樣品,共得到247個(gè)EST序列,其中正向消減文庫(kù)203個(gè),反向消減文庫(kù)44個(gè),文庫(kù)中EST序列與已知基因的匹配率達(dá)到78.16％。運(yùn)用Blast2go軟件對(duì)序列進(jìn)行分類(lèi),反向文庫(kù)包括:細(xì)胞分化(2％),細(xì)胞過(guò)程(31％),死亡(5％),

9、代謝過(guò)程(32％),生物周期(9％),定位(7％),應(yīng)激(14％);正向文庫(kù)包括:細(xì)胞過(guò)程(23％),免疫過(guò)程(1％),死亡(5％),應(yīng)激(3％),細(xì)胞組成(3％),新陳代謝(19％),細(xì)胞凋亡(1％),發(fā)育過(guò)程(5％),生命周期(10％),繁殖(1％),細(xì)胞組成(5％),多細(xì)胞機(jī)體過(guò)程(1％),定位(13％),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(2％)。GenBank序列號(hào)為JK729464-JK729642。運(yùn)用熒光定量技術(shù)對(duì)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)一步對(duì)部分基