苯并[α]芘對櫛孔扇貝生殖毒性效應(yīng)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，簡稱PAHs)是持久性有機(jī)污染物的主要代表，具有內(nèi)分泌干擾特性。近年來，隨著海上石油和輪船運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展以及工業(yè)、生活污水的大量排放，海洋環(huán)境中PAHs的污染日益加重。但有關(guān)PAHs對污染物的指示生物一雙殼貝類生殖毒性的研究較少，國內(nèi)更未見報(bào)道。本論文以苯并[α]芘(B[α]P)作為PAHs的代表，研究了B[α]P對櫛孔扇貝性腺中激素水平、雌激素受體和卵黃蛋白原的

2、基因表達(dá)以及顯微結(jié)構(gòu)的影響，并初步探討了B[α］P對櫛孔扇貝的生殖毒性機(jī)制，得到了如下結(jié)果： 1.苯并[α]芘對櫛孔扇貝性腺中睪酮和雌二醇含量的影響 激素對于生物體的生長發(fā)育生殖等過程具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度(0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L)的B[α]P，分別于6d和15d取樣，通過放射性試劑盒測定了櫛孔扇貝精巢和卵巢中睪酮和雌二醇含量的變化。結(jié)果表明，B[α]P能夠降低櫛孔扇貝性腺中

3、睪酮和雌二醇的含量，除15d時(shí)，2.5μg/L B[α]P能夠顯著降低卵巢中的雌二醇含量(P<0.05)外，其它處理組在6d和15d時(shí)對睪酮和雌二醇含量的影響不顯著(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)表明，B[α]P能夠通過降低櫛孔扇貝性腺中睪酮和雌二醇的含量而發(fā)揮內(nèi)分泌干擾作用。 2.櫛孔扇貝雌激素受體(ER)基因的克隆與序列分析 本實(shí)驗(yàn)通過相近物種ER氨基酸序列的同源性比對，根據(jù)保守氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，利用RT-PCR以及R

4、ACE技術(shù)成功克隆了櫛孔扇貝ER的完整cDNA序列。將櫛孔扇貝的ER與其它物種的ER進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，ER具有高度保守性，尤其是在DNA結(jié)合區(qū)(DBD)，櫛孔扇貝ER的DBD與牡蠣ER的DBD相似性為98％，與人ERα的DBD相似性為87％，而所選物種間配體結(jié)合區(qū)(LBD)的保守性相對較低。通過ER的組織特異性研究發(fā)現(xiàn)，ER在所選組織中均有表達(dá)，且在雌性性腺中表達(dá)量較高。 3.櫛孔扇貝卵黃蛋白原(VTG)基因的克隆與序列分析

5、 根據(jù)NCBI上收錄的相近物種的VTG氨基酸序列在線設(shè)計(jì)兼并引物，通過RT-PCR以及RACE技術(shù)成功克隆了櫛孔扇貝VTG的部分cDNA序列。將櫛孔扇貝的VTG與其他物種的VTG進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，櫛孔扇貝的VTG與同一科物種的VTG具有較高的相似性(78％-89％)，與同一目物種的VTG具有36％-43％的相似性，而與其它無脊椎動物以及卵生脊椎動物VTG的相似性較低，只有21％-33％。通過VTG的組織特異性研究發(fā)現(xiàn)，VTG只在

6、櫛孔扇貝雌性性腺中表達(dá)，說明VTG在櫛孔扇貝中也是雌性特異的。 4.苯并[α]芘對櫛孔扇貝性腺中ER和VTG基因表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝曝污于不同濃度(0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L)的B[α]P，分別于1d，3d，6d，10d，15d取樣，通過半定量RT-PCR技術(shù)測定了櫛孔扇貝性腺中ER和VTG表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，2.5μg/L B[α]P處理15d時(shí)能夠顯著降低櫛孔扇貝卵巢中ER和VTG的基

7、因表達(dá)量(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)6d時(shí)，各處理組櫛孔扇貝卵巢中ER和VTG的基因表達(dá)量均略微高于對照組水平(P>0.05)，隨后又逐漸降低；實(shí)驗(yàn)期間，在櫛孔扇貝精巢中未檢測到VTG的表達(dá)且各處理組ER的基因表達(dá)量與對照組水平無顯著差異。本實(shí)驗(yàn)說明B[α]P對櫛孔扇貝最終表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)，能夠通過影響雌激素應(yīng)答基因的表達(dá)而造成生殖毒性。 5.苯并[α］芘對櫛孔扇貝性腺顯微結(jié)構(gòu)的影響 性腺的質(zhì)量是繁殖成敗的關(guān)鍵。，本實(shí)驗(yàn)將