胃癌相關(guān)幽門螺桿菌差異基因文庫的構(gòu)建及差異基因篩選.pdf

1、幽門螺桿菌(Helibobactor pylori，H pylori)在人的胃內(nèi)定植，是引起慢性胃炎的主要原因，并與消化性潰瘍、胃癌、B淋巴細胞相關(guān)性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。研究表明，通常H pylori感染者發(fā)生淺表性胃炎很普遍，但只有少數(shù)感染者會出現(xiàn)嚴重的臨床結(jié)局，如：消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌等。宿主感染細菌的臨床結(jié)局與細菌毒力因素、宿主反應和環(huán)境因素有關(guān)。來自于不同個體的H pylori基因組均包含大約1600個基因，其中

2、大約320個基因為非必需的，100個基因為菌株特異性的。有證據(jù)表明，這些遺傳學的差別可能影響了H pylori毒力因子的功能和抗原性，對于產(chǎn)生不同的臨床結(jié)局具有重要作用[4]，特別是H pylori致病相關(guān)基因，如：cagA，vacA和iceA等的差異，與感染的臨床結(jié)局密切相關(guān)[5,6]。美國一項研究表明，在動物模型中，感染cagA菌株的動物更容易發(fā)生消化性潰瘍，萎縮性胃炎及胃癌等，感染cagA菌株可以減少胃癌的發(fā)生。在歐美一些地區(qū)，特

3、殊的vacA slml基因型菌株是致病性的標志，這樣的菌株在體外產(chǎn)毒活性高，在體內(nèi)可以引起嚴重的上皮細胞損傷。如在哥斯達黎加，感染vacA slb和vacA m1基因型菌株經(jīng)年齡、性別校正后與胃癌的發(fā)生有關(guān)。在南非研究發(fā)現(xiàn)，感染jceA1型菌株與胃癌的發(fā)生有關(guān)。由此可見，感染不同基因亞型的H.pylori菌株與產(chǎn)生不同的臨床結(jié)局密切相關(guān)。 除了vacA，cag致病基因島外，其他與疾病相關(guān)的多態(tài)性位點也可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如

4、研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌jhp940位點，以往通過基因型或功能生物學分析認為其無功能，近期許多不同國家研究發(fā)現(xiàn)其在與胃癌相關(guān)的菌株中出現(xiàn)，由JHP940所誘導的炎性細胞因子在慢性胃炎及胃癌中具有重要作用。由此可見，鑒定菌株特異性基因位點對于了解H. pylori的致病機制、探索不同疾病來源菌株的標志基因、尋找疾病相關(guān)性H.pylori治療靶點意義重大，可以為分析菌株遺傳分化關(guān)系，建立分子鑒別新體系及分子流行病學研究提供重要基礎。目的構(gòu)建胃癌相

5、關(guān)H.pylori差異基因文庫并篩選差異基因，期望找到可能與胃癌發(fā)生相關(guān)的H.pylori基因序列，探討H.pylori致病基因的疾病相關(guān)性，為進一步揭示H. pylori相關(guān)性胃疾病的致病機制、探索疾病相關(guān)的細菌菌株的分子標志、尋找疾病相關(guān)性H.pylori治療靶點提供線索和實驗依據(jù)。 方法： 選取1999-2004在遼寧省莊河地區(qū)接受胃鏡普查者活檢標本355例，男174例，女181例；年齡21～79(平均年齡49.3

6、3)歲；沈陽臨床胃鏡活檢標本136例，男69例，女57例；年齡25～78(平均48.61)歲，取新鮮胃粘膜4塊，其中3塊(胃竇、體、角各1塊)進行病理組織學檢查，另1塊進行H.pylori培養(yǎng)。經(jīng)中國醫(yī)科大學倫理委員會批準，以問卷調(diào)查或病歷記錄方法收集所有研究對象的年齡、性別和相關(guān)臨床資料，并與其簽署知情同意書。 利用HE染色對所取胃粘膜標本進行組織病理學診斷。采用腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基對H.pylori進行常規(guī)培養(yǎng)。利用常規(guī)酚——

7、氯仿方法提取H.pylori菌種DNA。采用PCR法擴增H.pylori cagA、vacAs、vacAm、iceA1和iceA2基因。通過胃癌來源株L301 和淺表性胃炎來源株B975之間的抑制消減雜交，構(gòu)建胃癌來源H.pylori高、低拷貝基因文庫。采用斑點雜交、基因測序和blastn同源性分析進一步篩選鑒定胃癌來源H.pylori菌株高、低拷貝基因。采用PCR法擴增篩選出的胃癌來源株高拷貝基因序列。統(tǒng)計分析采用χ2檢驗或Fishe

8、r’s Exact Test比較計數(shù)資料的組間差異。 結(jié)果： 1、不同疾病組H.pylori cagA，vacA，jceA基因檢測發(fā)現(xiàn)GA組感染m2(43.1％)亞型菌株構(gòu)成比最高，與GU(18.2％)和GC(17.9％)組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.015，P=0.020)，與GS(30.00％)組相比差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.084)。在GA組中，感染s1m2亞型菌株有22例(44.9％)，與本組病例中其他基因亞

9、型相比差別均有統(tǒng)計學意義，與GU、GC組感染s1m2亞型菌株相比差別有統(tǒng)計學意義(P=0.039)，與GS組相比差別沒有統(tǒng)計學意義(P=0.067)。未發(fā)現(xiàn)cagA，iceA基因亞型在不同疾病組中存在差別。 2、構(gòu)建了胃癌來源株L301和淺表性胃炎來源株B975差異基因文庫。L301高拷貝基因同源性分析結(jié)果顯示，其主要分為四類，包括：信息的存儲和加工、細胞病變和信息傳遞、復制重組修復和功能未知基因等。L301低拷貝基因同源性分析

10、結(jié)果顯示，其主要分為五類，包括：核酸轉(zhuǎn)運和代謝、細胞病變和信息傳遞、代謝、信息的存儲和加工、功能未知基因等。 3、利用自行設計PCR引物對差異基因之一肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶基因片段進行了擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在19例胃癌來源株中陽性者有10例(52.6％)，在23例淺表性胃炎來源株中未見一例有陽性表達，二者差別有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。 結(jié)論： 1、遼寧地區(qū)感染H. pylori vacAslm2型菌株與萎縮性