蘋果汁中耐熱菌的分離鑒定與PCR快速檢測的研究.pdf

1、酸土脂環(huán)酸芽抱桿菌(A.acidoterrestris)，簡稱耐熱菌，是重要的食品工業(yè)腐敗菌。其顯著特點是可以在溫度20～70℃和pH2.0～6.0的高溫低酸環(huán)境下生長。該菌芽孢的耐熱能力分別為85℃時56min、90℃時15min、95℃時24min，因此巴氏滅菌不能除去此菌。在濃縮果汁中嗜酸耐熱菌不繁殖代謝，但一旦稀釋成低濃度的飲用果汁時，在常溫下即代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、鹵酚，使果汁口感風(fēng)味變差、濁度升高、形成沉淀導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降。歐美

2、各國要求每10克蘋果濃縮汁中耐熱菌的含量小于1個，耐熱菌逐漸成為我國蘋果濃縮汁行業(yè)產(chǎn)品出口所遭遇的主要的技術(shù)壁壘。我國對耐熱菌研究屬于起步階段，主要集中在分離方法和控制上。果汁中芽孢桿菌菌種分布的研究和快速檢測方面的研究也比較缺乏。 PCR技術(shù)是聚合酶鏈反應(yīng)(Polymorase Chain Reaction，PCR)，80年代逐漸發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化突出優(yōu)點。傳統(tǒng)方法檢測

3、食源性微生物(有益細(xì)菌，腐敗菌，病原細(xì)菌)的步驟繁瑣費時，需經(jīng)富集培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定以及必要的動物試驗等過程。并且傳統(tǒng)方法無法對那些難以人工培養(yǎng)的微生物進行檢測。目前常用的耐熱菌檢測方法是常規(guī)的培養(yǎng)檢測法，耗時很長，一般需要4-5日才能出檢測報告。而應(yīng)用PCR技術(shù)，只需數(shù)小時就可以檢測出目的菌。 試驗選擇了耐熱菌的16SrDNA的高變區(qū)V2區(qū)和V4區(qū)某一段作為特異性引物的接合區(qū)域，以實現(xiàn)對此種

4、微生物的特異的快速檢測。通過試驗研究得到以下結(jié)論： 1.從本研究結(jié)果看出：在蘋果汁中生長的酸土環(huán)脂酸芽抱桿菌不是單一的菌，而是形態(tài)不同，生理生化性質(zhì)不同，營養(yǎng)利用狀況不同的菌群。除此之外，還有別的脂環(huán)酸芽孢桿菌菌種存在。 2.通過優(yōu)化試驗，最優(yōu)PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 5μL，10xbuffer KCl 2.5μL，濃度為25mmol/μl的Mg2+2.5μL，濃度為2.5mmol/μL的dNTPS 2μL，濃度為1

5、0μg/L的正反引物各0.5μL，濃度為5U/μL，的Taq DNA聚合酶0.25μL，總體積25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min后進入PCR循環(huán)，循環(huán)程序是94℃變性30S，58℃30S，72℃30S，擴增35個循環(huán)后72℃延伸5min。 3.得出耐熱菌DNA最佳提取方法：比較了CATB法、氯化芐法、水浴煮沸法和微波爐提取法，發(fā)現(xiàn)微波爐提取法是最佳DNA模板提取法，其優(yōu)點是效率高，單管操作，簡便快捷，費時最少。