奶粉中耐熱芽孢菌的分離及快速檢測方法的建立.pdf

1、芽孢菌是奶粉中常見的污染菌，嚴重影響著產(chǎn)品品質，嗜熱脂肪地芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌同時也是煉乳等罐頭食品中常見的平酸腐敗菌。耐熱芽孢菌能夠產(chǎn)生大量的蛋白酶、脂肪酶等各種酶類，降低食品的感官品質與營養(yǎng)價值。同時這些微生物還能間接反應食品生產(chǎn)車間的衛(wèi)生狀況，因此，對這些耐熱芽孢菌的快速檢測及消毒具有重要研究意義。
　　 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)是一種新型核酸擴增技術，利用4條特異性引物，選擇性地使用環(huán)引物，可以實現(xiàn)核酸的快速特異

2、性擴增。該技術不需要昂貴的PCR儀，僅僅在恒溫條件下就能完成擴增，檢測結果特異性高，反應高效，操作方便，可以廣泛應用于微生物核酸的快速檢測。
　　 本研究對哈爾濱周邊某工廠的奶粉樣中進行耐熱菌的分離鑒定，得到一株耐熱芽孢菌，命名為KLDS9.1101。對其進行顯微鏡觀察、培養(yǎng)、生長曲線測定，確定其為革蘭氏陽性，最適生長溫度為55℃，經(jīng)16S rDNA分子鑒定，屬于好熱黃無氧芽孢菌。
　　 本課題研究對好熱黃無氧芽孢菌、嗜

3、熱脂肪地芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌的spo0A基因進行比對，以spo0A基因部分片段為靶基因設計出了LAMP引物。通過培養(yǎng)，提取出菌體DNA作為反應模板。對LAMP反應的溫度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度以及Mg2+濃度等進行了優(yōu)化。最后確定LAMP擴增最優(yōu)體系為:內(nèi)引物FIP和BIP各1.6μmol/L、外引物F3和B3各0.2μmol/L、環(huán)引物LB和LF各0.8μmol/L，2.5μL10×buffer，0.6mol/L甜菜堿，immo

4、l/L dNTPs，8mmol/L MgSO4，2μL模板，用ddH2O補足24ul;95℃預處理5min冷卻后，再加入1μL BstDNA聚合酶8U，63℃下恒溫擴增30～60min，最后在80℃下加熱10min使酶失活。擴增產(chǎn)物可以采用凝膠電泳、HNB和鈣黃綠素進行結果檢測，陽性變化明顯，可以清晰判斷是否發(fā)生擴增。
　　 將常見芽孢桿菌的DNA提取物作為LAMP反應模板，進行LAMP特異性和靈敏度的驗證。結果表明，只有好熱黃

5、無氧芽孢菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌的提取物發(fā)生了擴增，其余均未擴增，表明spo0A基因的選擇和引物設計良好。靈敏度試驗表明，檢測限能夠達到8CFU/mL。LAMP檢測法特異性強，高效迅速，與傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比更高效省力，與普通PCR法相比靈敏度更高，不需要昂貴PCR儀設備。
　　 利用過氧乙酸作為消毒劑，好熱黃無氧芽孢菌為試驗菌株進行消毒試驗，0.3gNa2S2O3+100mL PBS作為中和劑，試驗結果表明，過氧乙酸