奶粉中耐熱芽孢菌的分離及快速檢測(cè)方法的建立.pdf

1、芽孢菌是奶粉中常見的污染菌，嚴(yán)重影響著產(chǎn)品品質(zhì)，嗜熱脂肪地芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌同時(shí)也是煉乳等罐頭食品中常見的平酸腐敗菌。耐熱芽孢菌能夠產(chǎn)生大量的蛋白酶、脂肪酶等各種酶類，降低食品的感官品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)這些微生物還能間接反應(yīng)食品生產(chǎn)車間的衛(wèi)生狀況，因此，對(duì)這些耐熱芽孢菌的快速檢測(cè)及消毒具有重要研究意義。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用4條特異性引物，選擇性地使用環(huán)引物，可以實(shí)現(xiàn)核酸的快速特異

2、性擴(kuò)增。該技術(shù)不需要昂貴的PCR儀，僅僅在恒溫條件下就能完成擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果特異性高，反應(yīng)高效，操作方便，可以廣泛應(yīng)用于微生物核酸的快速檢測(cè)。
　　 本研究對(duì)哈爾濱周邊某工廠的奶粉樣中進(jìn)行耐熱菌的分離鑒定，得到一株耐熱芽孢菌，命名為KLDS9.1101。對(duì)其進(jìn)行顯微鏡觀察、培養(yǎng)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定，確定其為革蘭氏陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度為55℃，經(jīng)16S rDNA分子鑒定，屬于好熱黃無氧芽孢菌。
　　 本課題研究對(duì)好熱黃無氧芽孢菌、嗜

3、熱脂肪地芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的spo0A基因進(jìn)行比對(duì)，以spo0A基因部分片段為靶基因設(shè)計(jì)出了LAMP引物。通過培養(yǎng)，提取出菌體DNA作為反應(yīng)模板。對(duì)LAMP反應(yīng)的溫度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度以及Mg2+濃度等進(jìn)行了優(yōu)化。最后確定LAMP擴(kuò)增最優(yōu)體系為:內(nèi)引物FIP和BIP各1.6μmol/L、外引物F3和B3各0.2μmol/L、環(huán)引物L(fēng)B和LF各0.8μmol/L，2.5μL10×buffer，0.6mol/L甜菜堿，immo

4、l/L dNTPs，8mmol/L MgSO4，2μL模板，用ddH2O補(bǔ)足24ul;95℃預(yù)處理5min冷卻后，再加入1μL BstDNA聚合酶8U，63℃下恒溫?cái)U(kuò)增30～60min，最后在80℃下加熱10min使酶失活。擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用凝膠電泳、HNB和鈣黃綠素進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，陽(yáng)性變化明顯，可以清晰判斷是否發(fā)生擴(kuò)增。
　　 將常見芽孢桿菌的DNA提取物作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)模板，進(jìn)行LAMP特異性和靈敏度的驗(yàn)證。結(jié)果表明，只有好熱黃

5、無氧芽孢菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌的提取物發(fā)生了擴(kuò)增，其余均未擴(kuò)增，表明spo0A基因的選擇和引物設(shè)計(jì)良好。靈敏度試驗(yàn)表明，檢測(cè)限能夠達(dá)到8CFU/mL。LAMP檢測(cè)法特異性強(qiáng)，高效迅速，與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法相比更高效省力，與普通PCR法相比靈敏度更高，不需要昂貴PCR儀設(shè)備。
　　 利用過氧乙酸作為消毒劑，好熱黃無氧芽孢菌為試驗(yàn)菌株進(jìn)行消毒試驗(yàn)，0.3gNa2S2O3+100mL PBS作為中和劑，試驗(yàn)結(jié)果表明，過氧乙酸