PCR-RFLP快速檢測和鑒定尿液中念珠菌的實驗研究.pdf

1、目的：嘗試模擬真菌感染尿液的制備，探索聚合酶鏈反應結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR—RFLP)快速檢測和鑒定念珠菌的方法。 方法：采用溶細胞酶(Lyticase)結(jié)合Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌基因組DNA，同時與十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取結(jié)果進行比較。采用PCR—RFLP技術，即對核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的編碼基因進行擴增后，用MspI

2、酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生不同的特異帶型，對50份不同念珠菌的模擬尿液標本進行檢測和鑒定，并與常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果進行比較，同時檢測該技術的敏感性、特異性。 結(jié)果：1．Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取的DNA含量明顯高于十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法，差異有顯著性(p＜0.01)。2．真菌通用引物對模擬尿液中常見的白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌進行擴增，結(jié)果均為陽性，在520bp左右均擴增出一清晰的條帶。3．應

3、用通用引物分別對模擬白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌感染尿標本作PCR，檢測的敏感度均為10CFU/ml。4．PCR產(chǎn)物酶切后進行0．8％聚丙酰胺凝膠垂直電泳，條帶清晰，條帶之間分離明顯，產(chǎn)生了四種不同的特異性帶型，將四種常見念珠菌區(qū)分開來。5．PCR—RFLP對模擬標本檢測和鑒定結(jié)果明顯高于常規(guī)培養(yǎng)(p＜0.005)，PCR—RFLP法與常規(guī)培養(yǎng)法具有較好的一致性(k=0.789，p＜0.01)。 結(jié)論：PCR