環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測果汁中耐熱菌的研究.pdf

1、分類號：IS2QZ：壘密級：公玨單位代碼：!QQ墨魚學號：2QQ墨l蘭量環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測果汁中耐熱菌的研究Study011loopmediatedisothermalAmplification(LAMP)fortheRapidDetectionofAlicyclobacillusacidoterrestrisinJuice學位申請人：陳靜指導教師：袁耀武教授張偉教授學科專業(yè)：微生物學學位類別：理學碩士授予單位：河北農業(yè)大學答辯

2、日期：0年五月二十九日摘要酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(彳acidoterrestris)，簡稱耐熱菌(ATB)，是重要的食品工業(yè)腐敗菌。其顯著特點是可以在溫度20“70℃和pH20～60的高溫低酸環(huán)境下生長。因此巴氏滅菌不能除去此菌。在濃縮果汁中該菌不繁殖代謝，但一旦稀釋成低濃度的飲用果汁時，在常溫下即代謝產生愈創(chuàng)木酚、鹵酚，使果汁口感風味變差、濁度升高、形成沉淀導致產品品質下降。歐美各國要求每lOg蘋果濃縮汁中耐熱菌的含量小于1個，耐熱菌逐漸

3、成為我國蘋果汁行業(yè)產品出口所遭遇的主要技術壁壘。我國對耐熱菌的研究屬于起步階段，主要集中在分離方法和控制上。果汁中耐熱菌快速檢測方面的研究比較缺乏。傳統(tǒng)的檢測耐熱菌的方法操作繁瑣、檢測時間較長，通常需要4“7d才能完成，并且靈敏度較低。因此需要建立一種快速、靈敏的檢測果汁中耐熱菌的方法。環(huán)介導等溫擴增(100pmediatedisothermalamplification，簡稱LAMP)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種新的核酸擴增

4、技術。該技術以其靈敏度高、特異性強、快速、操作簡便、檢測成本低等優(yōu)點在病毒、真菌、細菌以及轉基因食品的檢測中得到應用。因此，建立LAMP技術檢測耐熱菌對于控制耐熱菌引起果汁變質具有重要意義。本文確定了耐熱菌的培養(yǎng)方法、菌體計數方法，研究了DNA提取方法，并制備了DNA提取液，作為LAMP檢測的模板。選擇NCBI公布的耐熱菌的保守序列AB042057，使用在線軟件(https：／／primerexplorerjp／lamp300／inde

5、xhtml)設計LAMP反應的6條引物。對反應條件進行優(yōu)化，建立了LAMP的反應體系為：內引物(FIP和B口)各18mmol／L，外引物(F3和B3)各03mmol／L，環(huán)引物(LB)09mmol／L，Mg十濃度為3mmol／L，dNTPs濃度5mmol／L，8U的BstDNA聚合酶大片段，2此DNA模板。LAMP的反應過程為：先在63℃水浴鍋中反應20min，然后在80℃水浴鍋中水浴10min終止反應。反應結束后，通過肉眼觀察有無白色

6、焦磷酸鎂沉淀即可判斷LAMP反應是否發(fā)生，亦可通過瓊脂糖凝膠電泳證實反應是否發(fā)生。利用LAMP方法對8株耐熱菌菌株，6株脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的非耐熱菌菌株和13株其它芽孢桿菌進行特異性試驗。結果表明，8株耐熱菌為陽性，其他19株菌株為陰性。為了評估LAMP檢測耐熱菌靈敏度和人工污染檢出限，進行了PCR反應，PCR反應的引物是LAMP的兩條外引物(F3和B3)。結果表明，LAMP檢測耐熱菌的靈敏度為225CFU／mL，人工污染耐熱菌的果汁的檢

7、出限為225CFU／mL。采用試劑盒提取DNA，2h內即可完成反應。對照PCR耗時3h，檢測耐熱菌的靈敏度為225CFU／mL，人工污染耐熱菌的果汁的檢出限為2250CFU／mL。LAMP的靈敏度和檢出限是PCR方法的100倍。比較了6種模板制備方法對LAMP檢測果汁中耐熱菌的影響。研究表明LAMP方法對制各模板DNA的要求不高。采用熱裂解法提取DNA，不僅節(jié)約提取時間，而且也將大大降低檢測成本。研究表明LAMP方法將成為可以替代PCR