遺傳改良釀酒酵母發(fā)酵木糖生產乙醇的研究.pdf

1、能源危機和全球氣候變暖，導致人們迫切需要低成本的可再生能源。目前，木質纖維素被認為可以用來生產生物燃料。成功利用木質纖維素生產乙醇取決于對生物質水解的六碳糖和五碳糖的高效轉化。已有大量關于工程酵母利用木糖發(fā)酵乙醇的報道，但是和葡萄糖發(fā)酵相比，這些菌株對木糖的利用效率以及乙醇的產量相當?shù)?。因此，對釀酒酵母進行遺傳改良進行高效木糖發(fā)酵，很有必要。
　　本研究中克隆了酵母木糖發(fā)酵途徑中的關鍵基因XYL1，XYL2和XKS1，構建到組成型

2、表達載體pPYPGE15，并成功轉化到Ura3營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母PY001中。對得到的釀酒酵母轉化子進行酶活性的測定，酵母生長量以及木糖發(fā)酵產物測定等實驗。比較了XYL1和XYL2不同表達順序、融合表達XYL1-XYL2時酶活性的差異以及其對利用木糖發(fā)酵乙醇效率的影響。
　　實驗結果顯示，優(yōu)先轉錄XYL1的菌株PY001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1在所有時間段均表現(xiàn)出XYL1酶活性高于PY001/pYPGE15XYL2

3、XYL1XKS1，在培養(yǎng)48h時達到最高峰為0.027U/mg。優(yōu)先表達XYL2的菌株PY001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1表現(xiàn)出最高的XYL2的酶活性，在培養(yǎng)48h達到1.64U/mg。可以推斷基因在載體的轉錄順序會影響蛋白水平的表達，優(yōu)先轉錄的基因表達量較高。
　　使用連接肽(G4S1)1融合表達XYL1和XYL2蛋白時，酶活性均無明顯提高，使用連接肽(G4S1)3時，XYL1的活性與對照菌株相比無明顯變化，而XY

4、L2的活性提高了11倍左右。說明在融合表達XYL1-XYL2時，XYL1肽段的結構發(fā)生了改變，而XYL2肽段活性不受影響。
　　以1％木糖為唯一碳源進行限氧發(fā)酵時，PY001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1和PY001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1可以利用木糖進行緩慢生長，在培養(yǎng)72h后OD/600nm達到0.95左右，但乙醇產量太低而無法檢測。以1％木糖和2％葡萄糖為底物進行共發(fā)酵，PY001/pYPGE15X