木糖轉(zhuǎn)化乙醇代謝途徑在釀酒酵母工業(yè)菌株中的建立.pdf

1、該文通過敏感度實驗測定了G418和Cu<'2+>作用于三株釀酒酵母工業(yè)菌株SK-1、SPSC-1、NAN-27的最低抑菌濃度,發(fā)現(xiàn)三株菌對G418的敏感性差別很大,G418作用于SPSC-1酒精酵母的最低抑菌濃度達到750μg/ml,對SK-1釀酒酵母的最低抑菌濃度只有100μg/ml.同株菌在不同的培養(yǎng)基上對銅離子的耐受性相差也很大,SPSC-1酒精酵母在YEPD培養(yǎng)基上可以耐受15mmol/L Cu<'2+>,但在YNB基本培養(yǎng)基上

2、只可以耐受1mmol/L Cu<'2+>.對工業(yè)菌株釀酒酵母進行醋酸鋰法轉(zhuǎn)化的系列條件做了研究,確定OD<,600>值0.8-1.0時是最佳細胞收獲時間,轉(zhuǎn)化子先在完全培養(yǎng)基上生長6h再涂布G418選擇平板可以大大提高轉(zhuǎn)化子的數(shù)量.通過改進的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,使含銅抗性基因的質(zhì)粒KB806成功轉(zhuǎn)入工業(yè)酵母菌株SPSC-1和NAN-27中,初步解決了工業(yè)菌株轉(zhuǎn)化難的問題.在真菌中,木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的反應是在依賴NADPH的木糖還原酶(xyl

3、ose reductase, XR)作用下,將木糖還原為木糖醇,然后在依賴NAD的木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH)作用下,轉(zhuǎn)化木糖醇為木酮糖.接著木酮糖經(jīng)木酮糖激酶(xylulokinase, XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖,這步酶促反應是木糖代謝的限速步驟之一.因此我們將來自畢赤氏酵母Pichia stipitis的木糖還原酶基因(XYL1)、木糖醇脫氫酶基因(XYL2)和釀酒酵母自身的木酮糖激酶基

4、因(XKS1)連接到已構(gòu)建的單拷貝整合載體pYIK和多拷貝整合載體pYMIK上.PGK和ADH1啟動子均為釀酒酵母組成型強啟動子,而PGK啟動子的表達效力比ADH1啟動子強.將XYL1基因置于乙醇脫氫酶啟動子ADH1控制下,將XYL2基因置于磷酸甘油激酶啟動子PGK控制下,從而控制木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的表達量,減少因木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的輔酶不能相偶聯(lián),細胞內(nèi)氧化還原失衡所致的木糖發(fā)酵中的木糖醇積累.XKS1基因置于磷酸甘油

5、激酶啟動子PGK控制下.得到重組質(zhì)粒pYIK-123和pYMIK-127.將所構(gòu)建釀酒酵母重組菌在氧氣限量的條件下,進行木糖葡萄糖共發(fā)酵實驗.重組菌的生長情況和宿主菌沒有明顯區(qū)別,表明外源基因的引入對重組菌的生長沒有影響.發(fā)酵產(chǎn)物進行HPLC分析,結(jié)果表明各重組菌都能利用木糖產(chǎn)生乙醇.其中,以釀酒酵母工業(yè)菌株為宿主菌,多拷貝整合木糖還原酶(XR)基因、木糖醇脫氫酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)基因的釀酒酵母重組菌NAN-127利用木糖生

6、產(chǎn)乙醇的效果最優(yōu).對木糖的利用最高可達18.4g/L,較宿主菌提高了2倍,乙醇產(chǎn)量最高可達7.9g/L,較宿主菌提高39﹪.由此在釀酒酵母實驗室菌株和工業(yè)菌株中分別建立了細菌和真菌的兩條木糖代謝途徑.經(jīng)過比較,發(fā)現(xiàn)由rDNA介導的多拷貝整合木糖代謝酶基因的重組菌對木糖的利用和乙醇的產(chǎn)生都高于單拷貝整合木糖代謝酶基因的重組菌.并且以釀酒酵母工業(yè)菌株為宿主菌的重組菌對木糖的利用和乙醇的產(chǎn)生高于以實驗室菌株為宿主菌的重組菌,乙醇的產(chǎn)生速度也較