代謝木糖和葡萄糖產(chǎn)乙醇的重組釀酒酵母的構(gòu)建.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上最充分的有機(jī)資源。將木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素水解成葡萄糖和木糖并發(fā)酵產(chǎn)生乙醇正在被廣泛地研究。木糖發(fā)酵是植物纖維原料生物轉(zhuǎn)化制取乙醇商業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,但自然界存在的微生物菌株不能滿足商業(yè)化生產(chǎn)的需要。利用基因工程技術(shù)對(duì)酵母菌進(jìn)行改造,以提高它們的木糖發(fā)酵能力成為目前研究和開發(fā)的重點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了帶Candida shehatae木糖還原酶基因xy11的重組表達(dá)質(zhì)粒pACT2-xyll,運(yùn)用醋

2、酸鋰轉(zhuǎn)化法,將該質(zhì)粒導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)室營養(yǎng)缺陷型菌株YS58中得到重組菌YS58-xl。選菌落較大的兩株重組菌YS58-xla和YS58-xlb測定木糖還原酶的活性,結(jié)果比活力分別為0.26U/mg總蛋白和0.32U/mg總蛋白,是宿主菌木糖還原酶比活力的162.5倍和200倍,說明C.shehatae的木糖還原酶基因xyll在S.cerevisiae YS58中得到活性表達(dá)。選取YS58-xlb進(jìn)行木糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示重組菌YS58-x1

3、經(jīng)92h發(fā)酵后,消耗木糖6.688g/L,比宿主菌YS58提高了3.87倍：木糖醇產(chǎn)量為6.22 g/L,比YS58增加了10.5倍。研究結(jié)果表明,菌株YS58-xl可以在葡萄糖為輔助碳源時(shí),轉(zhuǎn)化木糖為木糖醇。這一特點(diǎn)對(duì)生物質(zhì)纖維材料的全利用極為有利,因?yàn)槔w維材料的水解物中總是葡萄糖(己糖)與木糖(戊糖)相伴存在的。 從工業(yè)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TMB3000中擴(kuò)增得到木糖醇脫氫酶基因xyl

4、2;將xyl2與帶強(qiáng)啟動(dòng)子PMA1的表達(dá)載體pDR195連接得到pDR195-xyl2。將重組表達(dá)質(zhì)粒pDR195-xyl2導(dǎo)入YS58中,得到重組菌YS58-X2。選兩株重組菌YS58-x2a和YS58-x2b進(jìn)行木糖醇脫氫酶活性測定,比活力分別為：0.0656U/mg總蛋白和0.07U/mg總蛋白,分別為宿主菌的16.4倍和17.5倍。說明S.cerevisiae TMB3000的xyl2基因超表達(dá)成功。 將pACT2-xy

5、ll導(dǎo)入YS58-x2b中,用同時(shí)缺亮氨酸(leu)和尿嘧啶(ura)的平板篩選得到重組菌YS58-xl-x2。帶有不相容性質(zhì)粒pACT2-xyl1和pDR195-xyl2的共轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接培養(yǎng)8d后,后代菌85％以上仍能在缺leu和ura的平板上生長,即同時(shí)含有兩種重組質(zhì)粒。說明在有合適選擇壓力的情況下,可以保證兩種不兼容質(zhì)粒在共轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定傳代。重組菌子中的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的活力與分別表達(dá)時(shí)的活力相當(dāng)。重組菌YS58-xl-x2

6、葡萄糖與木糖共底物發(fā)酵結(jié)果顯示,重組菌S.cerevisiae YS58-xl-x2對(duì)木糖的利用和乙醇的產(chǎn)率較宿主菌S.cerevisiae YS58都有提高。YS58-x1-x2對(duì)木糖的利用最高可達(dá)7.983g/L,較宿主菌提高了4.8倍,乙醇產(chǎn)量最高可達(dá)14.486 g/L,較宿主菌提高23.5％。說明木糖代謝相關(guān)基因在宿主體內(nèi)得到成功表達(dá),YS58-x1-x2已經(jīng)能利用木糖產(chǎn)酒精；同時(shí)還說明兩種不相容性質(zhì)粒不僅能在S.cerevi