代謝木糖和葡萄糖產乙醇的重組釀酒酵母的構建.pdf

1、木質纖維素是地球上最充分的有機資源。將木質纖維素中的纖維素和半纖維素水解成葡萄糖和木糖并發(fā)酵產生乙醇正在被廣泛地研究。木糖發(fā)酵是植物纖維原料生物轉化制取乙醇商業(yè)化生產的基礎和關鍵,但自然界存在的微生物菌株不能滿足商業(yè)化生產的需要。利用基因工程技術對酵母菌進行改造,以提高它們的木糖發(fā)酵能力成為目前研究和開發(fā)的重點。 實驗室前期已構建了帶Candida shehatae木糖還原酶基因xy11的重組表達質粒pACT2-xyll,運用醋

2、酸鋰轉化法,將該質粒導入實驗室營養(yǎng)缺陷型菌株YS58中得到重組菌YS58-xl。選菌落較大的兩株重組菌YS58-xla和YS58-xlb測定木糖還原酶的活性,結果比活力分別為0.26U/mg總蛋白和0.32U/mg總蛋白,是宿主菌木糖還原酶比活力的162.5倍和200倍,說明C.shehatae的木糖還原酶基因xyll在S.cerevisiae YS58中得到活性表達。選取YS58-xlb進行木糖醇發(fā)酵實驗,結果顯示重組菌YS58-x1

3、經92h發(fā)酵后,消耗木糖6.688g/L,比宿主菌YS58提高了3.87倍：木糖醇產量為6.22 g/L,比YS58增加了10.5倍。研究結果表明,菌株YS58-xl可以在葡萄糖為輔助碳源時,轉化木糖為木糖醇。這一特點對生物質纖維材料的全利用極為有利,因為纖維材料的水解物中總是葡萄糖(己糖)與木糖(戊糖)相伴存在的。 從工業(yè)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TMB3000中擴增得到木糖醇脫氫酶基因xyl

4、2;將xyl2與帶強啟動子PMA1的表達載體pDR195連接得到pDR195-xyl2。將重組表達質粒pDR195-xyl2導入YS58中,得到重組菌YS58-X2。選兩株重組菌YS58-x2a和YS58-x2b進行木糖醇脫氫酶活性測定,比活力分別為：0.0656U/mg總蛋白和0.07U/mg總蛋白,分別為宿主菌的16.4倍和17.5倍。說明S.cerevisiae TMB3000的xyl2基因超表達成功。 將pACT2-xy

5、ll導入YS58-x2b中,用同時缺亮氨酸(leu)和尿嘧啶(ura)的平板篩選得到重組菌YS58-xl-x2。帶有不相容性質粒pACT2-xyl1和pDR195-xyl2的共轉化子轉接培養(yǎng)8d后,后代菌85％以上仍能在缺leu和ura的平板上生長,即同時含有兩種重組質粒。說明在有合適選擇壓力的情況下,可以保證兩種不兼容質粒在共轉化子中穩(wěn)定傳代。重組菌子中的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的活力與分別表達時的活力相當。重組菌YS58-xl-x2

6、葡萄糖與木糖共底物發(fā)酵結果顯示,重組菌S.cerevisiae YS58-xl-x2對木糖的利用和乙醇的產率較宿主菌S.cerevisiae YS58都有提高。YS58-x1-x2對木糖的利用最高可達7.983g/L,較宿主菌提高了4.8倍,乙醇產量最高可達14.486 g/L,較宿主菌提高23.5％。說明木糖代謝相關基因在宿主體內得到成功表達,YS58-x1-x2已經能利用木糖產酒精；同時還說明兩種不相容性質粒不僅能在S.cerevi