釀酒酵母遺傳操作方法研究及乙醇發(fā)酵高產(chǎn)菌株構(gòu)建.pdf

1、隨著地球上化石能源(石油、煤炭、天燃?xì)獾?的日趨枯竭和全球環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，用生物乙醇(也稱燃料乙醇)取代部分汽油已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的可再生能源戰(zhàn)略。由于技術(shù)上的原因，目前燃料乙醇的生產(chǎn)主要是通過(guò)釀酒酵母對(duì)淀粉質(zhì)或糖質(zhì)原料的發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。以淀粉質(zhì)或糖質(zhì)原料為碳源進(jìn)行乙醇發(fā)酵，原料成本在生產(chǎn)總成本中占很大比例，這在一定程度上限制了燃料乙醇工業(yè)的發(fā)展。因此，提高釀酒酵母乙醇發(fā)酵過(guò)程中的原料利用率(糖—醇轉(zhuǎn)化率)以及降低生產(chǎn)過(guò)程中的能耗(如

2、：縮短發(fā)酵周期、采用濃醪發(fā)酵等)是關(guān)系到淀粉質(zhì)及糖質(zhì)原料乙醇發(fā)酵行業(yè)發(fā)展的重要課題。然而，釀酒酵母乙醇發(fā)酵的糖—醇轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵速率以及對(duì)乙醇的耐受力是受多基因調(diào)控的復(fù)雜遺傳性狀，很難通過(guò)傳統(tǒng)的誘變育種、代謝工程以及針對(duì)特定基因或代謝途徑的其它遺傳操作方法進(jìn)行改善。因此，采用全基因組系統(tǒng)工程的方法對(duì)釀酒酵母進(jìn)行遺傳改造無(wú)疑是解決上述問(wèn)題的有效途徑。
　　 本研究以YCplac33為載體，構(gòu)建帶有受半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的HO基因的質(zhì)

3、粒YCplac33-GHK。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株W303，通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)HO基因轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株交配型的轉(zhuǎn)換。通過(guò)菌落PCR分析菌株的交配型，選擇適當(dāng)交配型的酵母菌株進(jìn)行有性接合，獲得多倍體菌株HLH33和HLH34。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在濃醪發(fā)酵中，菌株HLH33和HLH34分別比對(duì)照菌株W303的乙醇產(chǎn)量提高了1.29％和3.57％；酵母菌株的乙醇產(chǎn)量和對(duì)乙醇及高滲透壓的抗性隨染色體倍數(shù)的增加而提高和增強(qiáng)。
　　 用芬苯達(dá)唑

4、(methyl benzimidazole-2-yl-carba-mate，MBC)處理多倍體菌株HLH34使之發(fā)生染色體缺失，得到一株乙醇發(fā)酵特性顯著改善的非整倍體酵母菌株HLH34-M。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在濃醪發(fā)酵中，菌株HLH34-M與對(duì)照菌株W303相比，發(fā)酵終點(diǎn)殘?zhí)墙档土?8.70％，乙醇產(chǎn)量提高了5.33％。同時(shí)，菌株HLH34-M對(duì)乙醇及高滲透壓的抗性明顯增強(qiáng)。研究結(jié)果證明，非整倍體菌株可以顯著地改善釀酒酵母的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)特性

5、。
　　 用常規(guī)重組DNA技術(shù)將編碼全局轉(zhuǎn)錄因子的基因SPT15和SPT3分別克隆到載體YEplac195上，得到質(zhì)粒YEplac195-SPT15和YEplacl95-SPT3；采用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變技術(shù)，獲得SPT15的等位基因spt15(Phe177Ser、Tyr195His、Lys218Arg)，并將其克隆到Y(jié)Eplac195載體上，得到質(zhì)粒YEplac195-spt15；此外，分別將SPT15和SPT3以及spt15

6、和SPT3共同克隆到Y(jié)Eplac195上，構(gòu)建出質(zhì)粒YEplac195-SPT15-SPT3和YEplac195-spt15-SPT3。上述所有質(zhì)粒上的SPT15和spt15均由TEF1強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控，而SPT3則由PGK1強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控。將所構(gòu)建的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入菌株W303，并對(duì)轉(zhuǎn)化子的乙醇發(fā)酵能力和乙醇及高滲透壓的抗性進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照菌株W303相比，過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子SPT15和spt15的菌株乙醇產(chǎn)量分別提高了1.14％和

7、0.23％；共同過(guò)量表達(dá)SPT15和SPT3及共同過(guò)量表達(dá)spt15和SPT3的菌株乙醇產(chǎn)量分別提高了2.05％和1.70％；過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子SPT3的菌株乙醇產(chǎn)量提高了1.25％，而且該菌株具有較強(qiáng)的乙醇及高滲透壓的抗性。研究結(jié)果說(shuō)明：在本研究實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)于SPT15和SPT3的遺傳操作可在一定程度上提高酵母的乙醇發(fā)酵能力。
　　 在確定甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)最佳誘變劑量的基