hDll1ext-Fc融合蛋白在CHO-S細(xì)胞的表達(dá)純化與初步鑒定.pdf

1、Notch基因首先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，由于該基因的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺口(notch)而得名。Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路廣泛存在于脊椎與非脊椎動(dòng)物體內(nèi)，它是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要路徑之一。Notch受體是由胞外區(qū)(extracellularNotch，ECN)和跨膜區(qū)/胞內(nèi)區(qū)(Notch transmembrane,NTM)兩個(gè)亞基組成的異二聚體，二者是通過共價(jià)鍵結(jié)合在一起的，并具有Ca2+依賴性。哺乳動(dòng)物中有多重Notch配體，與Delt

2、a高度相似的配體稱為Delta或Delta樣(Delta-like，Dll)，與Serrate相似的稱為Serrate或Jagged。目前發(fā)現(xiàn)人的notch配體共有5種，即Delta-like-1，Delta-like-3，Delta-like-4，Jagged1，Jagged2。作為人重要Notch配體之一的Delta樣配體1是由723個(gè)氨基酸組成的單次跨膜蛋白，其中胞外區(qū)含有539個(gè)氨基酸，由1個(gè)N端保守的DSL(Delta/Ser

3、rate/Lag2)基序和8個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列(epidermal growth factor-like repeats，EGF-R)結(jié)構(gòu)域組成，具有重要的生物學(xué)活性。該DSL結(jié)構(gòu)域結(jié)合Notch受體，促進(jìn)受體異二聚體分離，進(jìn)而受體活化激活下游信號(hào)，Notch受體經(jīng)過三次剪切，最終胞內(nèi)區(qū)釋放到細(xì)胞核，激活發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(hairy and enhancer of split，Hes)等靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和組織發(fā)生。

4、胞內(nèi)域功能還不太清楚，有研究表明Delta1的胞內(nèi)區(qū)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。
　　近幾年研究表明Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤發(fā)生有關(guān)，如Purow B W等人在2005年發(fā)現(xiàn)Notch1及Notch4配體Delta-like-1、Jagged1在多種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中過度表達(dá)，并且在聯(lián)合其他細(xì)胞因子的情況下，hDll1胞外區(qū)可以抑制造血干細(xì)胞的分化并促進(jìn)其增殖。魯茁壯等克隆表達(dá)了人Notch配體Delta-like-1（hDll1）

5、的胞外區(qū)，并經(jīng)過集落培養(yǎng)檢測(cè)證實(shí)其對(duì)原始的造血祖細(xì)胞具有擴(kuò)增作用。
　　終上所述，根據(jù)已知序列，將合成hDll1ext基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，NheⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接至pIRES2-EGFP-Fc中，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有kana+抗性的LB固體篩選培養(yǎng)基上，倒置過夜，次日挑選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證正確后測(cè)序，將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞，經(jīng)G418篩選高表達(dá)細(xì)胞系，利用rProteinA親和柱純化目

6、的蛋白，并通過檢測(cè)Notch下游信號(hào)分子Hes1的表達(dá)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)蛋白活性。
　　結(jié)果篩選得到了高效表達(dá)hDll1ext-Fc的CHO-S細(xì)胞株10C7，經(jīng)WAVE培養(yǎng)密度最高達(dá)到6.27×106cells/mL，培養(yǎng)近2周后，細(xì)胞大量死亡收得上清體積約1.1L，測(cè)定上清中目的蛋白濃度為47.8μg/mL，估計(jì)得到總目的蛋白為52.58 mg。將上述上清經(jīng)rProtein A親和柱純化獲得較高純度的融合蛋白，BCA

7、試劑盒測(cè)得蛋白濃度為1.5mg/mL，體積為30mL，最終得到的目的蛋白總量為45mg，可以得到rProtein A親和柱回收率為45mg/52.58mg=85.6％。配合生物活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，可溶性的hDll1ext-Fc能夠激活Hes1報(bào)告基因，并且能上調(diào)Notch下游分子Hes1的表達(dá)，證實(shí)其可以激活Notch通路。
　　本實(shí)驗(yàn)通過純化獲得的較高純度的具有生物學(xué)活性的hDll1ext-Fc融合蛋白，為后續(xù)研究它的功能奠定了重