乙腦病毒e蛋白的原核表達(dá)、純化及初步鑒定

1、<p>　　乙腦病毒E蛋白的原核表達(dá)、純化及初步鑒定</p><p>　　作者：高淑嫻，張偉，任君萍，雷迎峰，丁天兵，宋建華，馬文煜，徐志凱 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To construct gene encoding Japanese encephalitis virus (JEV) envelope glycoprotein and to ex

2、press E protein in BL21(DE3). METHODS: Using RTPCR, the gene encoding E protein was amplified. The gene was cloned into pET28a(+) and the recombinant plasmid pET286HisE was transformed into BL21(DE3). The 6HisE prot

3、ein expressed in BL21(ED3) was determined by SDSPAGE and Western Blotting. The expression product in inclusion body was purified by NiNTA chromatography. RESULTS: Seque</p><p>　　【Keywords】 encephalitis v

4、irus, Japanese; viral envelope proteins; recombinant fusion proteins </p><p>　　【摘要】目的： 構(gòu)建乙腦病毒（JEV）E蛋白重組載體并在原核細(xì)胞BL21(DE3)中表達(dá). 方法： 采用RTPCR擴(kuò)增片段,定向克隆入pET28a(+)中；重組載體pET28a6HisE轉(zhuǎn)化BL21(DE3),通過(guò)酶切、SDSPAGE和Weste

5、rn Blotting檢測(cè)其載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物包涵體經(jīng)NiNTA親和層析純化. 結(jié)果： 構(gòu)建得到原核融合重組載體pET28a6HisE；誘導(dǎo)后表達(dá)得到6HisE融合蛋白，純化得到表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行了初步的鑒定. 結(jié)論： 表達(dá)并純化得到JEV E蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 腦炎病毒，日本；病毒包膜蛋白質(zhì)類；重組融和蛋白質(zhì)類 </p><p><b

6、>　　0引言 </b></p><p>　　流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis, JE）簡(jiǎn)稱乙腦，是由嗜神經(jīng)的乙腦病毒（JEV）所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)性傳染?。?］. JEV屬包膜病毒科黃病毒屬，呈球型，直徑20～30 nm，核心含單股RNA，有衣殼，有三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M. E蛋白為糖蛋白，包裹在病毒的表面，它決定著病毒的毒力及其宿主范圍，不僅在與宿主

7、細(xì)胞受體結(jié)合及隨后的膜融合中發(fā)揮重要作用，而且可刺激產(chǎn)生中和抗體［2］. 我們對(duì)E蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)、純化及鑒定，為進(jìn)一步研究病毒的受體和病毒的感染機(jī)制提供了有利條件. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p>　　1.1材料pET28a(+)表達(dá)載體和XL10, BL21(DE3)宿主菌為本試驗(yàn)室保存. P1，P2引物合成及序列測(cè)定由三

8、博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成；限制性內(nèi)切酶、PMD18T，EXTaq聚合酶和連接試劑盒（寶航公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）；JEV鼠源性mAb和兔源多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；猴抗鼠紅外標(biāo)記二抗、羊抗兔紅外標(biāo)記二抗（Rockland公司）；紅外成像系統(tǒng)（LICOR公司）；高速低溫離心機(jī)（BECKMAN公司）；恒溫?fù)u床（上海智城公司）. </p><p><b>　　1.2方法 &

9、lt;/b></p><p>　　1.2.1片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建用Trizol提取JEV RNA，以8 μL RNA為模板,1 μL P1為引物,1 μL dNTP 65℃水浴5 min,冰浴1 min, 2 μL 10×RT緩沖液,4 μL 25 mmol/LMgCl2,1 μL RNaseout Recombinant Inhibitor, 42℃水浴2 min；加1 μL sup

10、erscriptTM混勻；42℃水浴50 s；70℃水浴15 min；加1 μL RAaseH混勻；37℃水浴20 min；將得到的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5′端引物：5′CGCTCGAGTTAAGCATGCATTGGTCGCTAA3′；3′端引物：5′CGGAATTCTTTAATCGTTGTCTGGGAATGGGCAATCGTGAC3′. 反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 50 s；55℃ 1 min；72℃ 1 min

11、30 s, 30個(gè)循環(huán)，72℃ 15 min.10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段. 將回收的PCR產(chǎn)物克隆入PMD18T載體中轉(zhuǎn)化Ecoli E..XL10感受態(tài)細(xì)胞，E</p><p>　　1.2.2工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析用載體構(gòu)建成功的菌種劃抗性平板，挑取單克隆在37℃培養(yǎng)至A600 nm為0.4～0.6，加入100 mg/L IPTG誘導(dǎo)4 h. 1000 r/min, 4℃

12、 10 min離心收菌. 棄上清后用PBS洗菌體，用去離子水重懸菌體. 加入2×SDS上樣緩沖液進(jìn)行樣品處理. 另離心收集菌體，以溶液STE(50 mmol/L Tris﹒Cl (pH 8.0) ,1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl)重懸菌體，超聲破菌（間隔10 s,超聲8 s,共15 min）. 分別收集上清和沉淀，上清用5×SDS上樣緩沖液處理，沉淀用1×SDS上樣緩沖液處理后

13、徹底重懸. 取上述各樣品做SDSPAGE用2.5 g/L考馬斯R25溶液室溫染色2 h后脫色. </p><p>　　1.2.3重組蛋白的鑒定同上取上清和沉淀樣品分別進(jìn)行處理并做SDSPAGE，隨后將電泳蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上（轉(zhuǎn)移緩沖液：甘氨酸39 mmol/L,Tris堿48 mmol/L,SDS 3.7 mg/L,甲醇200 ml/L），100 V轉(zhuǎn)移80 min 后用25 mmol/L TBS平衡NC

14、膜10 min,用0.5 g/L的脫脂奶4℃封閉5 h ，用TBS·T洗膜3次,10 min/次，1∶200稀釋JEV鼠源性mAb，1∶100稀釋JEV兔源性多抗，4℃孵育過(guò)夜，然后用TBS·T洗膜3次，10 min/次，再與1∶2500稀釋的猴抗鼠抗體和羊抗兔抗體分別孵育，4℃作用90 min后洗膜3次，10 min/次，然后進(jìn)行掃描分析. </p><p>　　1.2.4重組蛋白的純

15、化參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱（NiNTA）操作說(shuō)明進(jìn)行. 離心收集500 mL誘導(dǎo)宿主菌，冰浴15 min；按5 mL/g濕菌的比例加入含8 mol/L尿素的緩沖液B(pH 8.0),室溫下輕輕攪拌使細(xì)菌裂解至溶液清亮，4℃, 8563 g離心收集上清，棄去沉淀；將500 mL/L的NiNTA樹(shù)脂懸浮液1 mL與一定量的清亮裂解上清于室溫輕柔混勻（100 r/min搖動(dòng)60 min）后，將混合液裝柱；收集穿過(guò)峰，留小樣進(jìn)行

16、SDSPAGE；然后用緩沖液W(20 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗柱，再用緩沖液E(250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脫，收集洗脫液. 取不同峰值樣品進(jìn)行SDSPAGE分析. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物在大小約1500 bp處出現(xiàn)條帶（圖1），與預(yù)期大小相符. 序列

17、測(cè)定結(jié)果有三個(gè)堿基突變（第30位堿基C突變?yōu)門(mén)，第705位堿基A突變?yōu)镚，第1298位堿基T突變?yōu)锳），皆為無(wú)意義突變. </p><p>　　M: DL2000 DNA marker; 1: 空pET28a; 2: pET28aE雙酶切產(chǎn)物. </p><p>　　圖1pET28aE的酶切鑒定（略） </p><p>　　2.2融和蛋白E的表達(dá)與溶解形式的分析

18、經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)，在Mr約53 000處有明顯的條帶，與預(yù)期的6HisE融和蛋白大小一致. 融和蛋白主要以包涵體形體存在于沉淀中，但上清中也有少量的誘導(dǎo)表達(dá)的融和蛋白. 薄層掃描顯示其占菌體總蛋白的40%（圖2）. </p><p>　　M: 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker; 1: 空pET28a未誘導(dǎo)細(xì)胞; 2: 空pET28a誘導(dǎo)細(xì)胞; 3: 重組載體pET28aE未秀導(dǎo)細(xì)胞; 4: 重組載體pET28a

19、E誘導(dǎo)細(xì)胞; 5: 重組載體pET28aE誘導(dǎo)細(xì)胞裂解上清; 6: 重組載體pET28aE誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀. </p><p>　　圖2E蛋白的表達(dá)及可溶性分析（略） </p><p>　　2.3融和蛋白E的大量表達(dá)及純化利用NiNTA agarose 柱通過(guò)金屬螯合親和層析進(jìn)行純化，從大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌體的沉淀中變性、純化得到6His E融合蛋白. 純化的蛋白經(jīng)PE

20、G4000濃縮后經(jīng)透析除去尿素，應(yīng)用紫外光吸收法定量分析表明獲得蛋白的濃度約為0.759 g/L（圖3）. </p><p>　　2.4E蛋白的Western Blotting用Odyssey掃描，在預(yù)期大小處可見(jiàn)清晰條帶，提示純化的E蛋白較好地保持了與抗JEV的多抗和單抗的結(jié)合活性（圖4,5）. </p><p>　　M: 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker. 1: 空pET28a未誘導(dǎo)細(xì)胞; 2

21、: 空pET28a誘導(dǎo)細(xì)胞; 3: 重組載體pET28aE誘導(dǎo)細(xì)胞裂解上清; 4: 重組載體pET28aE誘導(dǎo)細(xì)胞裂解沉淀; 5~9: 純化的融和蛋白. </p><p>　　圖36HisE蛋白的純化（略） </p><p>　　1, 2: pET28aE誘導(dǎo)細(xì)胞; 3: pET28aE未誘導(dǎo)的細(xì)胞; 4: 空pET28a誘導(dǎo)的細(xì)胞; 5: 空pET28a未誘導(dǎo)的細(xì)胞. <

22、/p><p>　　圖4融合蛋白6HisE的JEV多抗Western Blotting鑒定（略） </p><p>　　1, 2: pET28aE誘導(dǎo)細(xì)胞; 3: pET28aE未誘導(dǎo)的細(xì)胞. </p><p>　　圖5融和蛋白6HisE的JEV mAb Western Blotting分析（略） </p><p><b>　　3

23、討論 </b></p><p>　　JEV與西尼羅病毒（West Nile virus, WNV）、登革病毒（Dengue virus, DV）同屬黃病科黃病毒屬成員［3］，其E蛋白有著與JEV E 蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)和功能，例如它們都有著三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ［2，4］. 蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ主要承擔(dān)著整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)的形成；結(jié)構(gòu)域Ⅱ包含一個(gè)融合環(huán)，推測(cè)其與病毒與宿主細(xì)胞的膜融合有關(guān)；而結(jié)構(gòu)域Ⅲ則被認(rèn)為是病毒

24、與宿主細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)的部位［2，5］. Chu等［4］用WNV E 蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ蛋白不僅能抑制WNV對(duì)C6/36細(xì)胞、Vero細(xì)胞的侵入，還能夠抑制DV2對(duì)這兩種細(xì)胞的入侵. </p><p>　　作為同屬病毒它們有著很相似的結(jié)構(gòu)和交叉的功能，但它們又有著種的特異性. 例如，研究已證明WNV E蛋白是三聚體，而不是像DV E 蛋白是二聚體，并且揭示和分析了WNV E蛋白的表位抗原位點(diǎn)［3］，揭示了DV2型E

25、 蛋白晶體結(jié)構(gòu)，明確了DV2 E 蛋白各區(qū)的功能［4］. 另外，已有報(bào)道用黃病毒科的其他病毒的E蛋白和E蛋白Ⅲ區(qū)蛋白成功的篩選到受體蛋白或受體復(fù)合物［6-8］. </p><p>　　目前JE仍然威脅著人類的健康，在亞洲國(guó)家每年仍有JE 50 000例，其中有10 000例死亡［9］. 然而關(guān)于JEV的致病機(jī)制到目前為止仍不明確. JEV的E蛋白在病毒與敏感細(xì)胞結(jié)合過(guò)程中起著重要的作用，JEV敏感細(xì)胞表面有病毒

26、的相應(yīng)受體，但其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)尚未明確. 由于E蛋白的真核表達(dá)糖基化過(guò)多，嚴(yán)重影響了E蛋白的生物學(xué)活性，我們力圖用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)E蛋白，在多次嘗試不同表達(dá)載體與宿主菌之后，成功的構(gòu)建了E蛋白的原核表達(dá)載體. 對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果表明，表達(dá)的E蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體裂解后的沉淀中（占表達(dá)總量的95%左右）. </p><p>　　表達(dá)的E蛋白經(jīng)純化后用SDSPAGE和Western Blot

27、ting鑒定，結(jié)果表明其Mr大約為53 000,與預(yù)期大小一致；表達(dá)的E蛋白均能與JEV的單抗和多抗結(jié)合，表明其具有較好的反應(yīng)原性. 實(shí)驗(yàn)中觀察到E蛋白與多抗的結(jié)合要強(qiáng)于與單抗的結(jié)合，分析其原因，可能是由于多抗所針對(duì)的抗原表位多，而單抗只針對(duì)單一抗原表位，因此蛋白與單抗的結(jié)合受到一定影響. </p><p>　　基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30400378） </p><p><b&

28、gt;　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ 馮國(guó)和,竇曉光,王玉梅，等. 流行性乙型腦炎DNA 疫苗研究新進(jìn)展［J］. 國(guó)外醫(yī)學(xué)流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè)，2005,(32):368-370. </p><p>　?。?］ Lin CW, Wu SC. A functional epitope determinant on domain III of the Jap

29、anese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizingantibody combining sites ［J］. J Virol, 2003,77(4):2600-2606. </p><p>　?。?］ Kanai R, Kar K, Anthony K, et al. Crystal structure of West N

30、ile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes ［J］. J Virol, 2006,80(22):11000-11008. </p><p>　?。?］ Chu JJ, Rajamanonmani R, Li J, et al. Inhibition of West Nile virus entry by using a recomb

31、inant domain Ⅲ from the envelope glycoprotein ［J］. J Gen Virol. 2005;86(Pt 2):405-412. </p><p>　　［5］ Modis Y, Ogata S, Clements D, et al. A ligandbinding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein ［J］

32、. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(12):6986-6991. </p><p>　?。?］ ReyesDel Valle J, ChavezSalinas S, Medina F, et al. Heat shock protein 90 and heat shock protein 70 are components of Dengue virus receptor c

33、omplex in human cells ［J］. J Virol, 2005,9(8):4557-4567. </p><p>　?。?］ Chu JJ, Leong PW, Ng ML. Charaterization of plasma membraneassociated proteins from Aedes albopictus mosquito(C6/36) cells that mediate

34、 West Nile virus binding and infection ［J］. Virology, 2005,339(2):249-260. </p><p>　?。?］ Reyesdel Valle J, del Angel RM. Isolation of putative dengue virus receptor molecules by affinity chromatography usin

35、g a recombinant E protein ligand ［J］. J Virol Methods, 2004,116(1):95-102. </p><p>　?。?］ Lin CW, Lin KH, Lyu PC, et al. Japanese encephalitis virus NS2BNS3 protease binding to phagedisplayed human brain pr