長(zhǎng)效GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的真核表達(dá)與生物活性鑒定.pdf

1、GLP-1(Glucagon-like peptide-1，胰高血糖素樣肽)是一種由胰高血糖素原基因翻譯表達(dá)的一種31個(gè)氨基酸的多肽，它通過與相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)。GLP-1可以顯著的提高一、二相胰島素分泌，降低胰高血糖素水平，并延緩胃排空，因?yàn)?GLP-1降低血糖的效應(yīng)具有血糖依賴性并且具有降低體重的作用，故GLP-1作為二型糖尿病的治療藥物時(shí)可以有效的避免低血糖的發(fā)生并緩解肥胖所造成的胰島素耐受。由于體內(nèi)二肽基肽酶對(duì)

2、于 GLP-1的特異性酶切和小分子多肽固有的高腎清除率，GLP-1體內(nèi)半衰期僅僅為2分鐘。當(dāng)前研究主要采用對(duì)GLP-1氨基酸位點(diǎn)修飾、替換和連接大分子蛋白的方法來為了延長(zhǎng)GLP-1的半衰期。具有代表性的GLP-1類似物有Exenatide（艾塞那肽）、Liraglutide（利拉魯肽）和Dulaglutide（杜拉魯肽）。
　　本課題中將GLP-1變體（A8G/G26E/R36G）通過肽鏈Linker連接在IgG2σ的Fc段上。利

3、用CHO-K1哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)構(gòu)建并表達(dá)了GLP-1 IgG2σFc融合蛋白。通過初步親和層析獲得了純度較高的重組融合蛋白，并在體內(nèi)和體外水平對(duì)GLP-1 Fc融合蛋白進(jìn)行了生物活性鑒定。
　　第一部分構(gòu)建 GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒并篩選出穩(wěn)定表達(dá)GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的CHO-K1穩(wěn)定細(xì)胞株
　　本部分研究將設(shè)計(jì)合成的GLP-1 IgG2σFc融合蛋白編碼序列（cDNA,918bp）使

4、用T4連接酶酶連入哺乳細(xì)胞表達(dá)載體SGLs載體中（7956bp），并通過測(cè)序確認(rèn)表達(dá)載體構(gòu)建成功(引物:5?-CAGGACCACGTCGTGCCAGT-3?)。在使用PvuI酶對(duì)表達(dá)載體酶切后，使用電穿孔轉(zhuǎn)染的方式將線性化表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至 CHO-K1細(xì)胞中，使用蛋白凝膠電泳和間接法ELISA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出高表達(dá)細(xì)胞株。經(jīng)過三輪的亞克隆篩選，最終獲得的細(xì)胞株蛋白表達(dá)水平達(dá)到1.2g/L。通過對(duì)連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)

5、，并根據(jù)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平和雜質(zhì)含量變化，在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12天后收獲培養(yǎng)上清。該部分研究成功構(gòu)建了 GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建并篩選出融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　第二部分建立GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的純化方法并對(duì)融合蛋白進(jìn)行鑒定分析
　　本部分研究的目的為探究從細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得純度較高融合蛋白的純化方法，并鑒定產(chǎn)物是否為目標(biāo)產(chǎn)物。首先通過離心收集細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)1

6、2天后的細(xì)胞上清，使用Protein A親和層析柱進(jìn)行親和層析，由于親和層析后的蛋白仍然含有降解產(chǎn)物和多聚體，因此進(jìn)一步進(jìn)行疏水層析，經(jīng)兩步純化獲得的融合蛋白，經(jīng)HPLC分析和SDS-PAGE分析,顯示蛋白純度高于90％。分別以抗GLP-1抗體和抗IgG Fc抗體為檢測(cè)抗體，對(duì)純化獲得的 GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白進(jìn)行Western-blotting檢測(cè)，驗(yàn)證了融合蛋白的完整性。
　　第三部分 GLP-1-IgG2σFc

7、融合蛋白的生物活性的體內(nèi)外研究
　　本部分內(nèi)容中，首先通過INS-1細(xì)胞中進(jìn)行了GSIS（葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)），胰島素ELISA測(cè)定證實(shí)GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白在高糖條件下可以促進(jìn)胰島素的分泌；同時(shí)通過熒光定量PCR檢測(cè)胰島素mRNA，也證實(shí)了融合蛋白具有促進(jìn)胰島素mRNA合成的作用。隨后，通過C57/BL6J小鼠OGTT試驗(yàn)，一方面確定融合蛋白具有降血糖作用，一方面初步確立了給藥劑量。在自發(fā)性肥胖糖尿病模型 K

8、KAy小鼠體內(nèi)進(jìn)行為期四周（給藥頻率為每三天給藥一次）的實(shí)驗(yàn)，與陽(yáng)性對(duì)照藥GLP-1-IgG4 Fc融合蛋白相比，GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白顯示出更為出色的降血糖作用以及體重控制效能。最后在食蟹猴體內(nèi)進(jìn)行了的半衰期測(cè)定試驗(yàn)，單次給藥0.1 mg/kg后， GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的半衰期為57.1小時(shí)，與Dulaglutide同實(shí)驗(yàn)體系下的半衰期(38小時(shí))相比，延長(zhǎng)了約50%，初步驗(yàn)證了融合蛋白在保持GLP-1藥效