乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白(S-preS1)在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定高效表達(dá).pdf

1、乙型肝炎是一種嚴(yán)重的全球性疾病，易引發(fā)肝硬化和肝癌。目前國內(nèi)外尚無顯著有效的乙肝治療方法，主要采用預(yù)防為主、治療為輔的方針。自從1981年第一代乙肝疫苗問世至今，乙型肝炎的蔓延得到有效地控制，全球肝癌的發(fā)生率下降了75％。目前全球廣泛使用的是利用基因工程技術(shù)在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的乙肝病毒表面抗原S蛋白(HBsAg)疫苗，接種疫苗后約有10-15％的人群無應(yīng)答或者低應(yīng)答，且一般不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。研制能克服現(xiàn)有乙肝疫苗缺陷的新型乙

2、肝疫苗已成為一項(xiàng)迫切的研究課題。
　　 研究表明，在主蛋白抗原S的基礎(chǔ)上增加額外的HBV表面抗原能夠增強(qiáng)免疫原性，含前S蛋白的重組乙型肝炎疫苗是第三代乙肝疫苗研發(fā)的重點(diǎn)，有望替代現(xiàn)在廣泛使用的基因工程疫苗。本研究的研究思路是將乙肝病毒S抗原基因和preS1抗原表位(21-47位氨基酸)基因組合形成融合基因，在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)S/preS1的穩(wěn)定高效表達(dá)。
　　 本研究采用轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控為主、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為輔的表達(dá)載體設(shè)計(jì)思想

3、，將S/preS1基因插入含有克服位置效應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子及mRNA運(yùn)輸及穩(wěn)定性調(diào)控元件的真核細(xì)胞表達(dá)載體，成功構(gòu)建表達(dá)乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位(21-47位氨基酸)融合蛋白(S/preS1)的真核表達(dá)載體HMRCHEF53u/Neo-S/preS1。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋克隆篩選，在96孔板內(nèi)獲得單克隆細(xì)胞27株，ELISA檢測(cè)表明均為陽性單克隆。將單克隆細(xì)胞經(jīng)過24孔板、6孔板傳入T25細(xì)

4、胞方瓶，再次ELISA檢測(cè)獲得13株較高S/preS1表達(dá)水平的單克隆細(xì)胞系。對(duì)13株細(xì)胞系進(jìn)行無血清懸浮批次培養(yǎng)，最終獲得了體外生長(zhǎng)性狀好、S/preS1表達(dá)效率高的重組細(xì)胞系10G6。RT-PCR結(jié)果顯示S/preS1基因在重組CHO細(xì)胞中得到表達(dá)，Westernblot印跡分析證實(shí)10G6細(xì)胞表達(dá)的S/preS1同時(shí)保留S和preS1的天然免疫原性。
　　 以活細(xì)胞密度、S/preS1累計(jì)表達(dá)量、葡萄糖消耗量及乳酸積累量為

5、觀察指標(biāo)，本研究考察了10G6細(xì)胞的生長(zhǎng)表達(dá)特性及穩(wěn)定性。有血清培養(yǎng)時(shí)10G6細(xì)胞的最高活細(xì)胞密度達(dá)到0.67×105cells/mL，S/preS1累積表達(dá)水平達(dá)到1.82μg/mL，培養(yǎng)終止時(shí)葡萄糖剩余4.73mM，乳酸累積量為9.85mM。通過計(jì)算得到10G6細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率μ和S/preS1表達(dá)速率qs/preS1分別為0.2d-1和1.23μg/106cells/d。無血清培養(yǎng)時(shí)10G6細(xì)胞的最高活細(xì)胞密度達(dá)到5.4×106c

6、ells/mL，S/preS1累積表達(dá)水平達(dá)到3.99μg/mL，培養(yǎng)終止時(shí)葡萄糖完全消耗，乳酸累積量為8.8mM。通過計(jì)算得到10G6細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率μ和S/preS1表達(dá)速率qs/preS1分別為1.54d-1和0.88μg/106cells/d。結(jié)果表明，10G6細(xì)胞在無血清培養(yǎng)時(shí)的比生長(zhǎng)速率μ高于有血清培養(yǎng)，S/preS1表達(dá)速率qs/preS1接近低于有血清培養(yǎng)。由于10G6細(xì)胞在無血清培養(yǎng)的活細(xì)胞密度明顯高于有血清培養(yǎng)，相應(yīng)

7、地S/preS1累積量也明顯高于的在10G6細(xì)胞在在有血清培養(yǎng)的水平。在為期約2月的連續(xù)15批次無血清培養(yǎng)中，各批次10G6細(xì)胞的活細(xì)胞密度基本保持在4×106cells/mL以上、活力維持在90％以上，反映10G6細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定性的S/preS1值基本穩(wěn)定在1-1.25mg/L水平，表明10G6細(xì)胞在無血清培養(yǎng)中具有良好的細(xì)胞生長(zhǎng)和穩(wěn)定的產(chǎn)物表達(dá)性狀，符合生物技術(shù)藥物規(guī)?；a(chǎn)細(xì)胞系的質(zhì)量要求。
　　 流加培養(yǎng)是當(dāng)前重組蛋白生產(chǎn)

8、的主流培養(yǎng)模式，流加培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，在培養(yǎng)過程中流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)液，有效地減緩乃至消除營(yíng)養(yǎng)限制因素，從而延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，提高細(xì)胞培養(yǎng)密度及細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物濃度。本研究以活細(xì)胞密度、細(xì)胞活力和S/preS1表達(dá)水平為觀察指標(biāo)，分別考察了包括細(xì)胞接種密度、流加培養(yǎng)基選擇、流加起始時(shí)間、培養(yǎng)溫度等重要工藝參數(shù)，建立了以CHOCDEfficientFeedTMB為流加培養(yǎng)基、接種密度為3×105cells/mL、流加起始時(shí)間

9、為2-3d、每48h按10％培養(yǎng)體積補(bǔ)充流加培養(yǎng)基、累計(jì)流加3次（30％培養(yǎng)體積）、起始培養(yǎng)溫度為37℃、培養(yǎng)6d后溫度下調(diào)至32℃、培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間17-20d為主要工藝參數(shù)的10G6細(xì)胞無血清流加培養(yǎng)工藝。
　　 采用所建立的10G6細(xì)胞無血清流加培養(yǎng)工藝，不同批次10G6細(xì)胞流加培養(yǎng)的活細(xì)胞密度達(dá)到7-10×106cells/ml、S/preS1的累積濃度達(dá)到17-20mg/L，較之于10G6細(xì)胞的在溫度設(shè)置為37℃的無血清培