抗CD20抗體在CHO細胞內高效表達的初步研究.pdf

1、本文對抗CD20抗體在CHO細胞內高效表達進行了研究。主要研究內容包括：
　?、怕《据d體對抗CD20抗體2F2表達的研究。慢病毒(Lentivirus)載體區(qū)別于一般地逆轉錄病毒載體在于，它不僅能感染分裂細胞，同時對非分裂細胞也具有很強的感染能力，它是以人類免疫缺陷型病毒HIV-1為基礎，進而改造發(fā)展而成的基因表達載體。在宿主體內，慢病毒載體將病毒RNA做為模板，合成雙鏈DNA，此后通過環(huán)化等一系列反應下，結合病毒整合酶的催化，

2、有效地整合進入到宿主的染色體中，具有遺傳特性隨著基因組的分裂進而分離，故可以實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達。并且它的感染效率更高，可以容納大片段外源基因，生物安全性良好。慢病毒以單拷貝的形式將外源基因有效地整合到宿主的染色體中，因此避免了克隆載體重復多拷貝而引起地基因沉默等現(xiàn)象，并且根據(jù)篩選基因的不同，可選用其他篩選方式，避免了使用抗生素篩選引起地長期選擇過程中的目的基因的丟失，縮短了時間降低了成本。不僅如此，通過包裝得到的假病毒顆粒還可以進行

3、反復感染的操作，以增加進入宿主細胞染色體中的外源基因的數(shù)目。因此本實驗嘗試采用慢病毒載體過表達抗CD20抗體2F2，實驗結果表明初次感染慢病毒載體后，ELISA檢測OD450值時大多為假陽性的細胞株，最高值只有0.149，通過反復感染假病毒后，不僅大幅度的提高了感染效率，減少了假陽性概率，而且ELISA檢測OD450值最高可達0.521。由此，我們得出結論:利用慢病毒載體過表達抗CD20抗體2F2，利用假病毒顆粒反復感染CHO細胞，可在

4、一定程度上提高抗CD20抗體2F2在CHO細胞內的表達水平。
　?、铺剿鲬酶咄糠诌x技術對提高抗CD20抗體表達量的影響。因為存在“位置效應”和目的基因整合進入宿主細胞基因組中拷貝數(shù)的不同，外源基因整合入宿主細胞的基因組后，各個細胞株之間的表達水平存在著顯著的差異。有研究表明，在整個混合克隆中僅有少于1％的高表達的細胞克隆株，因此要從上萬各細胞中挑選出符合要求的高表達細胞株，工作量繁雜且結果不理想。熒光激活細胞分選器，又稱為流式

5、細胞分選儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)，它是一臺集光電測量技術、單克隆抗體技術和電子生物技術為一體的先進檢測儀，每秒可分析上萬細胞，能夠快速地檢測細胞的體積、DNA水平、RNA水平、蛋白質表達等化學和物理性質，并且可對需要的細胞株進行分析分選，具有多指標測量、快速檢測、多數(shù)據(jù)大量采集、可對需要的生物顆粒或細胞株分選等特點。依據(jù)每個細胞的熒光特征和光散射，流式細胞分選儀從細胞群眾將特定的細胞快速分離出來。本實驗的設計思路是通過

6、分析細胞內報告蛋白(GFP)表達水平，進而間接分析抗CD20抗體2F2表達量的策略。綠色熒光蛋白(GFP)是一類重要的報告基因，不需要其它酶、底物或輔因子的參與即可自然發(fā)光，是一種從水母中分離出來的天然熒光蛋白質。利用雙順反子載體將報告基因與抗CD20抗體體基因共表達，再采用流式細胞分選儀檢測熒光強度，分選高表達報告基因的細胞株，從而獲得陽性克隆的目的細胞。結果顯示，利用流式細胞分選得到的陽性細胞群，再單克隆化操作后ELISA同步檢測，

7、OD450最大值為0.819，將傳統(tǒng)的有限稀釋法作為對照組，對照組OD450最大值僅為0.679，因此，我們得出結論，應用流式細胞分選的方法可以提高抗體表達量。
　?、强刂戚p重鏈比例對CHO細胞表達抗CD20抗體的影響。眾所周知，抗體是由四條多肽鏈構成的對稱結構，重鏈（H鏈）是其中兩條相對分子量較大且較長的相同多肽鏈;而輕鏈（L鏈）則是兩條相對分子量較小且較短的相同多肽鏈?？贵w重鏈結合蛋白(BiP)在內質網(wǎng)中與抗體輕鏈多肽短暫的結

8、合后，輕鏈可以聚合二聚體的形式分泌到細胞胞外。與抗體輕鏈組裝成四聚體前，抗體重鏈多肽將與BiP持續(xù)保持結合狀態(tài)，并且在缺乏抗體輕鏈多肽的前提下，重鏈最終將無法分泌到細胞胞外，細胞內的蛋白酶體會降解無法分泌到細胞胞外的重鏈多肽，這樣就降低了全抗體的單位生產(chǎn)率。因此，有學者認為過量的輕鏈多肽對于提高抗體表達量是至關重要的。然而傳統(tǒng)的抗體制備過程中，人們將抗體輕重鏈基因分別克隆在兩個相同的質粒載體上，表達抗體蛋白，然而這種方法存在著輕重鏈比例

9、不可控等缺點。因此，本實驗采用內部核糖體進入位點（IRES）將輕重鏈基因克隆至實驗室已構建的高表達載體GC-rich載體上，通過轉染G418篩選三周后，利用有限稀釋法隨機克隆，同時將共轉染的載體作為對照組，與對照組進行同步比較，結果顯示ELISA同步檢測，使用IRES挑取的克隆陽性率為67.7％(65/96)，OD450最大值為0.835;雖然對照組的克隆陽性率大致相同為70.8％(68/96)，但ELISA同步檢測，OD450最大值為