抗CD20抗體在CHO細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的初步研究.pdf

1、本文對抗CD20抗體在CHO細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)進(jìn)行了研究。主要研究內(nèi)容包括：
　　⑴慢病毒載體對抗CD20抗體2F2表達(dá)的研究。慢病毒(Lentivirus)載體區(qū)別于一般地逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在于，它不僅能感染分裂細(xì)胞，同時(shí)對非分裂細(xì)胞也具有很強(qiáng)的感染能力，它是以人類免疫缺陷型病毒HIV-1為基礎(chǔ)，進(jìn)而改造發(fā)展而成的基因表達(dá)載體。在宿主體內(nèi)，慢病毒載體將病毒RNA做為模板，合成雙鏈DNA，此后通過環(huán)化等一系列反應(yīng)下，結(jié)合病毒整合酶的催化，

2、有效地整合進(jìn)入到宿主的染色體中，具有遺傳特性隨著基因組的分裂進(jìn)而分離，故可以實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。并且它的感染效率更高，可以容納大片段外源基因，生物安全性良好。慢病毒以單拷貝的形式將外源基因有效地整合到宿主的染色體中，因此避免了克隆載體重復(fù)多拷貝而引起地基因沉默等現(xiàn)象，并且根據(jù)篩選基因的不同，可選用其他篩選方式，避免了使用抗生素篩選引起地長期選擇過程中的目的基因的丟失，縮短了時(shí)間降低了成本。不僅如此，通過包裝得到的假病毒顆粒還可以進(jìn)行

3、反復(fù)感染的操作，以增加進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體中的外源基因的數(shù)目。因此本實(shí)驗(yàn)嘗試采用慢病毒載體過表達(dá)抗CD20抗體2F2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明初次感染慢病毒載體后，ELISA檢測OD450值時(shí)大多為假陽性的細(xì)胞株，最高值只有0.149，通過反復(fù)感染假病毒后，不僅大幅度的提高了感染效率，減少了假陽性概率，而且ELISA檢測OD450值最高可達(dá)0.521。由此，我們得出結(jié)論:利用慢病毒載體過表達(dá)抗CD20抗體2F2，利用假病毒顆粒反復(fù)感染CHO細(xì)胞，可在

4、一定程度上提高抗CD20抗體2F2在CHO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。
　?、铺剿鲬?yīng)用高通量分選技術(shù)對提高抗CD20抗體表達(dá)量的影響。因?yàn)榇嬖凇拔恢眯?yīng)”和目的基因整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中拷貝數(shù)的不同，外源基因整合入宿主細(xì)胞的基因組后，各個(gè)細(xì)胞株之間的表達(dá)水平存在著顯著的差異。有研究表明，在整個(gè)混合克隆中僅有少于1％的高表達(dá)的細(xì)胞克隆株，因此要從上萬各細(xì)胞中挑選出符合要求的高表達(dá)細(xì)胞株，工作量繁雜且結(jié)果不理想。熒光激活細(xì)胞分選器，又稱為流式

5、細(xì)胞分選儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)，它是一臺(tái)集光電測量技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和電子生物技術(shù)為一體的先進(jìn)檢測儀，每秒可分析上萬細(xì)胞，能夠快速地檢測細(xì)胞的體積、DNA水平、RNA水平、蛋白質(zhì)表達(dá)等化學(xué)和物理性質(zhì)，并且可對需要的細(xì)胞株進(jìn)行分析分選，具有多指標(biāo)測量、快速檢測、多數(shù)據(jù)大量采集、可對需要的生物顆?；蚣?xì)胞株分選等特點(diǎn)。依據(jù)每個(gè)細(xì)胞的熒光特征和光散射，流式細(xì)胞分選儀從細(xì)胞群眾將特定的細(xì)胞快速分離出來。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路是通過

6、分析細(xì)胞內(nèi)報(bào)告蛋白(GFP)表達(dá)水平，進(jìn)而間接分析抗CD20抗體2F2表達(dá)量的策略。綠色熒光蛋白(GFP)是一類重要的報(bào)告基因，不需要其它酶、底物或輔因子的參與即可自然發(fā)光，是一種從水母中分離出來的天然熒光蛋白質(zhì)。利用雙順反子載體將報(bào)告基因與抗CD20抗體體基因共表達(dá)，再采用流式細(xì)胞分選儀檢測熒光強(qiáng)度，分選高表達(dá)報(bào)告基因的細(xì)胞株，從而獲得陽性克隆的目的細(xì)胞。結(jié)果顯示，利用流式細(xì)胞分選得到的陽性細(xì)胞群，再單克隆化操作后ELISA同步檢測，

7、OD450最大值為0.819，將傳統(tǒng)的有限稀釋法作為對照組，對照組OD450最大值僅為0.679，因此，我們得出結(jié)論，應(yīng)用流式細(xì)胞分選的方法可以提高抗體表達(dá)量。
　　⑶控制輕重鏈比例對CHO細(xì)胞表達(dá)抗CD20抗體的影響。眾所周知，抗體是由四條多肽鏈構(gòu)成的對稱結(jié)構(gòu)，重鏈（H鏈）是其中兩條相對分子量較大且較長的相同多肽鏈;而輕鏈（L鏈）則是兩條相對分子量較小且較短的相同多肽鏈?？贵w重鏈結(jié)合蛋白(BiP)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與抗體輕鏈多肽短暫的結(jié)

8、合后，輕鏈可以聚合二聚體的形式分泌到細(xì)胞胞外。與抗體輕鏈組裝成四聚體前，抗體重鏈多肽將與BiP持續(xù)保持結(jié)合狀態(tài)，并且在缺乏抗體輕鏈多肽的前提下，重鏈最終將無法分泌到細(xì)胞胞外，細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體會(huì)降解無法分泌到細(xì)胞胞外的重鏈多肽，這樣就降低了全抗體的單位生產(chǎn)率。因此，有學(xué)者認(rèn)為過量的輕鏈多肽對于提高抗體表達(dá)量是至關(guān)重要的。然而傳統(tǒng)的抗體制備過程中，人們將抗體輕重鏈基因分別克隆在兩個(gè)相同的質(zhì)粒載體上，表達(dá)抗體蛋白，然而這種方法存在著輕重鏈比例

9、不可控等缺點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）將輕重鏈基因克隆至實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的高表達(dá)載體GC-rich載體上，通過轉(zhuǎn)染G418篩選三周后，利用有限稀釋法隨機(jī)克隆，同時(shí)將共轉(zhuǎn)染的載體作為對照組，與對照組進(jìn)行同步比較，結(jié)果顯示ELISA同步檢測，使用IRES挑取的克隆陽性率為67.7％(65/96)，OD450最大值為0.835;雖然對照組的克隆陽性率大致相同為70.8％(68/96)，但ELISA同步檢測，OD450最大值為