釀酒酵母極性外排途徑相關(guān)基因的篩選與鑒定.pdf

1、極性外排途徑是真核細(xì)胞將胞內(nèi)合成的重要物質(zhì)靶向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上(或外)的重要途徑,其與真核生物細(xì)胞的生長、通信和極性建立等重要生命活動(dòng)的關(guān)系十分密切。尋找極性外排途徑相關(guān)新基因并揭示它們的新功能對該途徑的深入研究具有重要意義。早期Novick實(shí)驗(yàn)曾經(jīng)報(bào)道了一個(gè)篩選釀酒酵母溫度敏感型分泌缺陷突變體的方法,并且發(fā)現(xiàn)了23個(gè)極性外排途徑相關(guān)的SEC基因。但是,他當(dāng)時(shí)所設(shè)定的條件只能篩選出那些37℃分泌嚴(yán)重受阻,密度梯度離心后明顯沉入下層的突變體

2、細(xì)胞,而忽視了分泌受阻不明顯仍留在上層的突變體細(xì)胞。篩選Novick實(shí)驗(yàn)密度梯度離心后的上層細(xì)胞中被忽略的分泌缺陷突變體為發(fā)現(xiàn)新的極性外排途徑相關(guān)基因提供了可行性。本實(shí)驗(yàn)正是以密度梯度離心后的上層突變體(Novick實(shí)驗(yàn)棄掉的細(xì)胞)為研究對象,成功地篩選出了在Novick實(shí)驗(yàn)中未曾涉及過的溫度敏感型分泌缺陷突變體,并且獲得了一系列可能與極性外排途徑相關(guān)的新基因。目前取得的主要成果及結(jié)論如下:
　　 1、溫度敏感型分泌缺陷酵母突變

3、體的篩選及其分泌缺陷特性的鑒定。利用EMS誘變、兩次密度梯度離心、限制性溫度條件篩選等技術(shù)手段成功篩選出了560余個(gè)新的溫度敏感型分泌缺陷突變體。選取其中30個(gè)突變體進(jìn)行熱激(37℃處理1-2 h)前后胞內(nèi)和胞外的Invertase及Bg12p含量比較,發(fā)現(xiàn)所有突變體的這兩種酶都無法正常分泌到胞外去,證明我們篩選的突變體外排途徑確實(shí)受阻,而37℃培養(yǎng)1 h后電鏡觀察突變體細(xì)胞,未見胞內(nèi)分泌小泡的積累。
　　 2、基因組文庫挽救及

4、挽救片段分析。對30個(gè)分泌缺陷突變體進(jìn)行基因組文庫挽救,獲得了一批能夠挽救這些突變體的基因組DNA片段,并查明了它們所在的染色體位置、長度范圍及所包含的基因類別。
　　 3、功能基因驗(yàn)證。從基因組DNA挽救片段上分別克隆出單個(gè)候選基因,將克隆的候選基因與組成型表達(dá)載體pRS315連接后去挽救對應(yīng)的溫度敏感型分泌缺陷突變體,以查明DNA挽救片段中發(fā)揮挽救作用的具體基因,排除其它基因的干擾。目前為止已驗(yàn)證了LCB2,CDC14,TE