頂頭孢霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及頂頭孢霉vgb基因工程菌發(fā)酵代謝調(diào)控的研究.pdf

1、半合成頭孢菌素藥物屬β—內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，在國(guó)際上是主要的抗生素類(lèi)藥物，在抗生素類(lèi)藥物的數(shù)量中所占比例也逐年上升。半合成頭孢菌素的重要中間體之一7—氨基頭孢烷酸（7—ACA）是以頭孢菌素C（Cephalosporin C，CPC）為原料的，但頭孢菌素C的發(fā)酵生產(chǎn)成本較高，其中原因之一是頭孢菌素C發(fā)酵時(shí)的供氧能耗較高，約占發(fā)酵總成本的30％左右。提高供氧水平通常從設(shè)備和操作角度考慮，但不同程度地受到設(shè)備、能源或操作條件的制約。 對(duì)血紅

2、蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）的研究為解決供氧限制提供了一條新的途徑。在頂頭孢霉中導(dǎo)入血紅蛋白基因（Vitreoscilla globin gene，vgb），并在限氧的條件下得到表達(dá)，從而提高了菌體的攝氧能力，對(duì)頭孢菌素C的合成起到了促進(jìn)作用。這在工業(yè)生產(chǎn)上將有可能大大節(jié)省能耗，減少成本，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 本文就質(zhì)粒對(duì)頂頭孢霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及頂頭孢霉vgb基因工程菌的發(fā)酵過(guò)程作了較為系統(tǒng)的

3、研究。（1）通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體制備條件的探索，得到了較好的制備方法，使得原生質(zhì)體的釋放率達(dá)到109個(gè)/克濕菌體，并使用改進(jìn)的PEG/CaC12原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將帶有博來(lái)霉素篩選標(biāo)志的pYG715/vgb質(zhì)粒導(dǎo)入頂頭孢霉，在含博來(lái)霉素的篩選平板上得到轉(zhuǎn)化子。（2）建立并通過(guò)高產(chǎn)高拷貝質(zhì)粒菌株篩選模型，篩選出了相對(duì)高產(chǎn)的高拷貝質(zhì)粒的菌株，能在5μg/ml博萊霉素平板上良好生長(zhǎng)。對(duì)所篩選的幾種不同形態(tài)的菌落產(chǎn)抗能力進(jìn)行了比較，對(duì)含不同質(zhì)粒拷貝

4、數(shù)的菌株進(jìn)行了發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，證明了篩選模型的可行性。（3）對(duì)頂頭孢霉vgb基因工程菌發(fā)酵條件進(jìn)行了較為全面的研究。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交投影的方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得到了較好的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵單位比使用原培養(yǎng)基提高了97．5％。并對(duì)其發(fā)酵過(guò)程的工藝條件，如接種量、裝量、pH值、溫度等作了研究，發(fā)現(xiàn)最佳接種量為10％，最佳pH為5．3，最佳發(fā)酵溫度為25℃，當(dāng)裝量在20～40ml變化時(shí)，頭孢菌素C的產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化，而對(duì)照菌頭孢菌素