產(chǎn)黃頭孢霉cefG基因的克隆、表達與抗體制備的研究.pdf

1、β-內(nèi)酰胺類抗生素，通過干擾細菌細胞壁的合成并破壞已有細胞壁而起到殺菌的作用。目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素的全球銷量已達到150億美元，占著半合成抗生素市場的65％。這其中又以青霉素類(Penicillins)和頭孢菌素類藥物(Cephalosporins)為主導產(chǎn)品。頭孢菌素類藥物以其低毒、耐酸、可修飾位點多[1]等優(yōu)勢正日益成為抗生素市場的主流。目前頭孢菌素類藥物的銷售額占到整個抗生素市場的4成，美國達到45％，而日本甚至達到49.34

2、％。
　　 頭孢菌素類抗生素多是以頭孢菌素C(CPC)為原料得到7-氨基頭孢烷酸，在此基礎上再經(jīng)過化學修飾，得到各種半合成頭孢菌素藥物。CPC是頂頭孢霉屬的代謝產(chǎn)物，在它的生物合成中，最后一步反應是由脫乙酰頭孢菌素C(DAC)經(jīng)乙酰轉(zhuǎn)移酶催化變成CPC[2]，這個過程被證實是CPC生物合成的限速步驟[3]，其原因是乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達量太低。目前國內(nèi)針對乙酰轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因——cefG的研究并沒有太多報道。
　　 根據(jù)NC

3、BI上的查詢結(jié)果，產(chǎn)黃頭孢霉的cefG基因是一條含兩個內(nèi)含子的基因序列，無法從基因組直接擴增。本文采用體外合成的方法可以得到去掉內(nèi)含子的cefG基因。以NCBI報道的來源于菌株AJ404737的cefG序列作為模板，去掉內(nèi)含子，設計38條首尾互補的引物，通過Assembly PCR拼接成一條完整的DNA片段，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)有3個位點發(fā)生堿基缺失。通過定點突變的方法對缺失部分逐一修改，并通過競爭性PCR檢驗突變是否成功。每突變一個位點都經(jīng)過引

4、物設計、PCR擴增、DpnⅠ消化、轉(zhuǎn)化、驗證和測序幾個步驟，最終得到與NCBI上所登錄的完全匹配的cefG基因。
　　 為了得到較高產(chǎn)量和純度的乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白，用于抗體制備、免疫印跡檢測，本實驗構建了pET30-cefG表達質(zhì)粒，37℃下誘導表達出大量重組蛋白，且都是不溶的包涵體。將重組菌超聲破碎后，不溶部分用不同濃度尿素做梯度洗脫，最后用8M尿素溶解沉淀，所得乙酰轉(zhuǎn)移酶包涵體純度達到96％以上，達到抗體制備或免疫印記實驗要求。

5、
　　 將純化后的包涵體免疫6周齡的BALB/C雌鼠，約1個半月后取尾血得到抗血清。通過抗原包被的酶聯(lián)免疫分析技術(ELISA)檢測，所得抗體效價達到8000以上，完全滿足實驗需要。利用所得抗體，本文先繪制出乙酰轉(zhuǎn)移酶標準曲線以確定抗原最適檢測濃度，然后在大腸桿菌中檢測了乙酰轉(zhuǎn)移酶與菌體生長的關系，證明所制備抗體能夠用于體外檢測乙酰轉(zhuǎn)移酶。
　　 為了使克隆的cefG基因能與產(chǎn)黃頭孢霉基因組進行重組并順利表達，本實驗利用

6、威斯康辛大學D.cullen教授饋贈的質(zhì)粒pDH25構建了真核表達質(zhì)粒pDH25-cefG。同時制備產(chǎn)黃頭孢霉原生質(zhì)體，研究了原生質(zhì)體對潮霉素B的耐受性，確定其最低耐受濃度為6μg·mL-1。最后嘗試在不同電壓下用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒導入產(chǎn)黃頭孢霉原生質(zhì)體。
　　 本研究探討了采用ELISA法，快速、高效、精確地檢測乙酰轉(zhuǎn)移酶含量，在頭孢菌素生產(chǎn)菌的基因工程改造工作中取得了階段性成果，為進一步研究cefG基因在頭孢菌素生產(chǎn)菌中的