重組D-氨基酸氧化酶的表達、純化與固定化.pdf

1、三角酵母D-氨基酸氧化酶(TrigonopsisvariabilisD-AminoAcidOxidase，TvDAAO)是生產制藥中間體7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的一種具有重要工業(yè)價值的一種酶，用已經構建好TvDAAO的表達載體pLHB-3在大腸桿菌中經乳糖誘導發(fā)酵表達，獲得的菌體提取粗酶液，經以瓊脂為基質的樹脂P-IDA-Co一步純化后，于25℃，5％CP℃條件下檢測，每升發(fā)酵液的酶活為2900U，純酶比活為16U/mg，純化了1

2、6倍，純酶的收率為70％。將DAAO純酶液固定到環(huán)氧樹脂AmberzymeTM上，固定化酶的酶活達到142U/g，能夠連續(xù)10批轉化底物而酶活沒有明顯損失，對底物的轉化率達到98％以上。本文實驗數(shù)據(jù)表明，DAAO經親和層析后固定到環(huán)氧載體上可為其應用于工業(yè)當中提供很好的方法途徑。 我們構建了透明顫菌血紅蛋白(VitreioscillaHemoglobin，VHb)基因與TvDAAO基因的融合基因，來確認細菌血紅蛋白能否作為固定化

3、DAAO酶的氧供體從而提高DAAO酶活性。我們設計VHb的引物，并引入NcoI位點，用PCR方法擴增出VHb基因，將其克隆到pLHB-3中DAAO基因的前端獲得表達載體pLX01，通過測序，序列正確，將pLX01與未融合VHv基因的pLHB-3質粒同時做誘導表達作對照，表達活性并沒有明顯提高。 為獲得新的DAAO基因，用RT-PCR方法從粘紅酵母(Rhodotorulagracilis)中獲得DAAO的cDNA并將其克隆到pRS