重組D-氨基酸氧化酶的表達(dá)、純化與固定化.pdf

1、三角酵母D-氨基酸氧化酶(TrigonopsisvariabilisD-AminoAcidOxidase，TvDAAO)是生產(chǎn)制藥中間體7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的一種具有重要工業(yè)價(jià)值的一種酶，用已經(jīng)構(gòu)建好TvDAAO的表達(dá)載體pLHB-3在大腸桿菌中經(jīng)乳糖誘導(dǎo)發(fā)酵表達(dá)，獲得的菌體提取粗酶液，經(jīng)以瓊脂為基質(zhì)的樹(shù)脂P-IDA-Co一步純化后，于25℃，5％CP℃條件下檢測(cè)，每升發(fā)酵液的酶活為2900U，純酶比活為16U/mg，純化了1

2、6倍，純酶的收率為70％。將DAAO純酶液固定到環(huán)氧樹(shù)脂AmberzymeTM上，固定化酶的酶活達(dá)到142U/g，能夠連續(xù)10批轉(zhuǎn)化底物而酶活沒(méi)有明顯損失，對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到98％以上。本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，DAAO經(jīng)親和層析后固定到環(huán)氧載體上可為其應(yīng)用于工業(yè)當(dāng)中提供很好的方法途徑。 我們構(gòu)建了透明顫菌血紅蛋白(VitreioscillaHemoglobin，VHb)基因與TvDAAO基因的融合基因，來(lái)確認(rèn)細(xì)菌血紅蛋白能否作為固定化

3、DAAO酶的氧供體從而提高DAAO酶活性。我們?cè)O(shè)計(jì)VHb的引物，并引入NcoI位點(diǎn)，用PCR方法擴(kuò)增出VHb基因，將其克隆到pLHB-3中DAAO基因的前端獲得表達(dá)載體pLX01，通過(guò)測(cè)序，序列正確，將pLX01與未融合VHv基因的pLHB-3質(zhì)粒同時(shí)做誘導(dǎo)表達(dá)作對(duì)照，表達(dá)活性并沒(méi)有明顯提高。 為獲得新的DAAO基因，用RT-PCR方法從粘紅酵母(Rhodotorulagracilis)中獲得DAAO的cDNA并將其克隆到pRS