d-型氨基酸氧化酶特異性抑制劑對骨癌痛的作用及其作用機制的研究.pdf

1、骨癌痛是臨床晚期癌癥患者常出現(xiàn)的并發(fā)癥，不僅給病人帶來無限痛苦、降低其生活質(zhì)量，而且增加了家庭的經(jīng)濟負擔?，F(xiàn)實中，一些癌癥如乳腺癌、前列腺癌和肺癌經(jīng)常從患病部位發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，引起骨癌痛。它一種難以控制的慢性疼痛。因此，為了減輕患者的痛苦，改善患者的生活質(zhì)量，迫切需要開發(fā)安全、療效確切的治療癌痛的藥物，而研究骨癌痛發(fā)展的病理機制則為治療癌痛藥物的開發(fā)起到極大地促進作用。近年來數(shù)個能夠模擬臨床癌痛的骨癌痛模型被成功建立，為骨癌痛的臨床前研究奠

2、定了實驗基礎。
　　 D-型氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO，EC1.4.3.3）是一種廣泛存在于生物體過氧化物小體內(nèi)以核黃素(FAD)為輔基的黃素酶，它可立體特異性型的以D-型氨基酸為底物，使之氧化脫氨生成相應的α-酮酸、氨和過氧化氫。在哺乳動物體內(nèi)，主要表達在腎臟、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（包括低腦干、小腦和脊髓中），僅分布在星形膠質(zhì)細胞。King's Lab最近研究發(fā)現(xiàn):D-型氨基酸氧化酶可能是一

3、種治療慢性疼痛的潛在性靶點分子;并初步提出假設:該D-型氨基酸氧化酶作為靶點的鎮(zhèn)痛機制可能是通過降低脊髓過氧化氫的含量而起到鎮(zhèn)痛作用。眾所周知，活性氧與疼痛的發(fā)生和調(diào)節(jié)密切相關。目前文獻報道的DAAO抑制劑有苯甲酸鈉、AS057278（5-methylpyrazole-3-carboxylic acid）、compound2(3-hydroxyquinolin-2-(1H)-one)、CBIO(5-chloro-benzo[d] iso

4、xazol-3-ol)等，而CBIO則是目前已知特異性最佳、效能最高的DAAO抑制劑。因此，本課題針對DAAO抑制劑CBIO對由癌細胞誘導的骨癌痛（慢性疼痛）的作用進行了研究和探討，并對DAAO特異性抑制劑CBIO的鎮(zhèn)痛作用機制進行了初步的探討。
　　 為了研究脊髓DAAO是否是治療骨癌痛的分子靶標，我們首先成功建立了大鼠骨癌痛模型。注射Walker256大鼠乳腺癌細胞到Sprague-Dawley大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)誘導骨癌痛模型

5、。手術后，分別通過電子Von Frey纖維和輻射熱刺激方法檢測了大鼠雙側(cè)后肢爪縮腳反應閾值（paw withdrawal threshold，PWT）和爪縮腳反應潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。脛骨孵育Walker256癌細胞能夠時間依賴性的誘導手術側(cè)爪縮腳反應閾值(PWT)的降低，手術15天后達到最低值，并且維持該水平至少數(shù)周;而非手術側(cè)PWT對機械性刺激的敏感度沒有顯著性變化。同樣，熱輻射引起的雙側(cè)爪

6、縮腳反應潛伏期在檢測的各個時間點也沒有出現(xiàn)顯著性的變化。因此，脛骨內(nèi)孵育Walker256癌細胞可產(chǎn)生機械性疼痛超敏，但不誘導熱痛敏。
　　 其次，考察了大鼠脛骨內(nèi)注射Walker256乳腺癌細胞后是否影響骨癌痛大鼠脊髓DAAO mRNA、蛋白及其酶活性變化，同時也檢測了Walker256癌細胞對大鼠脊髓GFAP(glial fibrillary acidic protein) mRNA和蛋白表達的影響。運用實時熒光定量PCR、

7、western blot、酮酸法等分子生物學技術對其進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)脛骨內(nèi)孵育Walker256細胞能夠時間依賴式的升高脊髓DAAO mRNA、蛋白和酶活性;而且GFAP mRNA和蛋白也被調(diào)高，提示大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞被大量活化。
　　 再次，驗證了DAAO特異性抑制劑CBIO能否對骨癌痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，利用電Von Frey法檢測系統(tǒng)性和鞘內(nèi)注射CBIO骨癌痛大鼠雙側(cè)足爪縮腳反應閾值的變化，以考察兩種給藥方式的鎮(zhèn)痛效果。研

8、究發(fā)現(xiàn)不管是鞘內(nèi)或是皮下注射CBIO皆可劑量依賴性和時間依賴性對骨癌痛產(chǎn)生抑制作用，抑制效果達46-48％;作用時間持續(xù)至少2小時，作用峰值時間在給藥后1小時;且不管是鞘內(nèi)注射還是系統(tǒng)性注射CBIO對非手術側(cè)腳足爪縮腳反應閾值沒有顯著性影響。同時初步探討了DAAO抑制劑CBIO對骨癌痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的作用機理，研究發(fā)現(xiàn)CBIO抑制脊髓DAAO活性，降低了脊髓過氧化氫的產(chǎn)生，進而導致脊髓星形膠質(zhì)細胞活化的減輕，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。
　　

9、 最后，疼痛耐受性限制了鎮(zhèn)痛藥物臨床治療中的使用;因此，我們研究了DAAO特異性抑制劑CBIO能否產(chǎn)生疼痛耐受性。連續(xù)7天(b.i.d)皮下注射CBIO，用電子Von Frey法檢測骨癌痛大鼠雙側(cè)后肢足爪縮腳反應閾值的變化。研究表明:連續(xù)7天(b.i.d)皮下注射CBIO沒有產(chǎn)生疼痛耐受性以及與嗎啡產(chǎn)生交叉耐受性;不僅如此，共同注射CBIO和嗎啡對骨癌痛產(chǎn)生疊加鎮(zhèn)痛作用;同時連續(xù)皮下注射CBIO能夠反轉(zhuǎn)嗎啡誘導疼痛耐受性和反轉(zhuǎn)嗎啡誘導

10、的μ阿片受體表達的降低。
　　 綜上所述，脛骨接種Walker256大鼠乳腺癌細胞能夠誘導機械性疼痛，但不產(chǎn)生熱痛;而且機械性疼痛的發(fā)展過程與DAAO mRNA、蛋白以及酶活性的調(diào)高保持同步發(fā)生，同時，以GFAP為生物標記物的星形膠質(zhì)細胞也被大量活化;DAAO特異性抑制劑CBIO通過抑制脊髓DAAO酶活性能夠有效阻斷骨癌痛，其作用機制可能是通過降低脊髓過氧化氫的含量，從而反轉(zhuǎn)星形膠質(zhì)細胞的活化，進而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應;此外，DAAO特