多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的研究.pdf

1、近年來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率一直呈明顯上升趨勢(shì),用于惡性腫瘤治療的方法主要包括放射治療、手術(shù)治療和藥物治療,其中對(duì)于實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的治療,藥物治療占有重要地位,特別是腫瘤化療取得了很大程度上的進(jìn)步。多西他賽是目前廣泛研究應(yīng)用的一種新型紫杉烷類(lèi)抗腫瘤藥物,其作用機(jī)制是通過(guò)刺激導(dǎo)管素的聚合,加強(qiáng)微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用,導(dǎo)致形成穩(wěn)定的非功能性微管束,因而破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂。多西他賽在臨床上被廣泛地應(yīng)用于卵巢癌、乳腺癌、非小

2、細(xì)胞肺癌和其它多種癌癥的治療。但多西他賽由于溶解度差、生物利用度低及毒性大等使其臨床應(yīng)用受到限制,目前臨床應(yīng)用的劑型僅為注射液,泰索帝(R)和多帕菲(R),該注射劑含有大量非離子表面活性劑Tween-80。其中藥物本身或吐溫-80會(huì)引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)如過(guò)敏反應(yīng),體液潴留,神經(jīng)、骨骼肌肉毒性和中性粒細(xì)胞減少癥等,限制了其臨床應(yīng)用。因此,研究、探索新型高效、低毒藥物給藥系統(tǒng)成為藥劑學(xué)研究熱點(diǎn)之一。
　　本課題旨在研發(fā)新的給藥系統(tǒng)提高多

3、西他賽的水溶性,避免吐溫-80表面活性劑的使用,同時(shí)選擇合適的腫瘤靶向因子將抗癌藥物專(zhuān)一性或選擇性的輸送到腫瘤組織,減少藥物在正常組織器官的分布,降低其對(duì)正常組織器官的毒副作用,利于未來(lái)用于癌癥的治療。
　　本研究課題首次制備三種不同類(lèi)型的可生物降解的脂質(zhì)納米混懸劑:一、被動(dòng)靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑(DTX-lipid-based-docetaxel-nanosuspensions,DTX-LNS);二、長(zhǎng)循環(huán)多西他賽脂質(zhì)納米混

4、懸劑(pLNS);三、葉酸介導(dǎo)的主動(dòng)靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑(tLNS)。本課題對(duì)這三種多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑進(jìn)行了系統(tǒng)的理化性質(zhì)研究、藥效學(xué)評(píng)價(jià),以及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為和體內(nèi)組織分布行為研究,研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　一、多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑藥物含量測(cè)定方法的建立
　　采用高效液相色譜法測(cè)定多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑中多西他賽的含量,并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明此方法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng),能準(zhǔn)確測(cè)定多西他賽的含量

5、。
　　二、被動(dòng)靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的研究
　　采用高壓均質(zhì)法制備DTX-LNS,采用冷凍干燥法以甘露醇作為凍干保護(hù)劑制備DTX-LNS凍干制劑。使用透射電鏡觀察粒子外觀形態(tài),ZETASIZER3000激光粒度分布與電勢(shì)分析儀考察其粒徑、粒徑分布。采用透析袋法考察其體外釋藥行為。腫瘤細(xì)胞毒性研究中,以多西他賽市售注射液多帕菲(R)為對(duì)照組,采用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)測(cè)定多帕菲(R)、DTX-LNS和Blank-LNS

6、對(duì)卵巢癌細(xì)胞株(SK-OV-3)和小鼠黑色素瘤細(xì)胞株(B16)的細(xì)胞毒性作用。藥效學(xué)研究中,進(jìn)行了DTX-LNS與市售多帕菲啦射液對(duì)荷小鼠黑色素瘤(B16)昆明鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果的比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示在優(yōu)化條件下采用高壓均質(zhì)法制備DTX-LNS,制得的納米混懸劑粒子形態(tài)規(guī)整,平均粒徑為200.0±3.42 nm,zeta電位為-11.15±0.99 mV,穩(wěn)定性好。多帕菲(R)與DTX-LNS體外釋藥均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型,釋放曲線擬合

7、方程分別為:DTX-LNS:1n(100-Q)=-0.1961 t+4.5543,r=0.9946,多帕菲(R):1n(100-Q)=-0.1859 t+4.4038,r=0.9991.。多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的細(xì)胞毒性與多帕菲@注射液的細(xì)胞毒性相當(dāng)。體內(nèi)藥效學(xué)研究結(jié)果表明,與多帕菲(R),LNS作為抗腫瘤藥物載體可通過(guò)被動(dòng)靶向作用,使藥物蓄積于腫瘤部位,增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用同時(shí)降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用。采用高壓勻質(zhì)發(fā)制備的DTX-

8、LNS,可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),粒徑小,體內(nèi)抑瘤效果好,毒性低,是一種具有開(kāi)發(fā)上市潛力的藥物新劑型。
　　三、長(zhǎng)循環(huán)和主動(dòng)靶向多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的研究
　　采用高壓均質(zhì)法以PEG修飾的脂質(zhì)載體材料制得表面有PEG修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)納米混懸劑(pLNs)。利用葉酸上的羧基與DSPE-PEG上的氨基通過(guò)DCC反應(yīng)制得DSPE-PEG-FA,將DSPE-PEG-FA摻入脂質(zhì)載體材料中成功制備主動(dòng)靶向脂質(zhì)納米混懸劑(tLNS)。使用透射

9、電鏡觀察粒子外觀形態(tài),ZETASIZER3000激光粒度分布與電勢(shì)分析儀考察其粒徑、粒徑分布。采用透析袋法考察其體外釋藥行為。腫瘤細(xì)胞毒性研究中,采用噻唑藍(lán)比色法(MTT法)研究多帕菲(R)、pLNs、tLNS、Blank-pLNS和Blank-tLNS對(duì)細(xì)胞表面低表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株(HepG2)和細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞小鼠黑色素瘤細(xì)胞株(B16)的細(xì)胞毒性作用。藥效學(xué)研究中,進(jìn)行了pLNS、tLNs與市售多帕

10、菲(R)注射液對(duì)荷小鼠黑色素瘤(B16)昆明鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果的比較。藥物代謝與組織分布研究中,比較pLNS、tLNS與市售多帕菲(R)在荷小鼠黑色素瘤(B16)昆明鼠中的分布,并進(jìn)行靶向性評(píng)價(jià)。
　　本部分制得的pLNS、tLNS的平均粒徑分別為204.2±6.18 nm、220.6±9.54 nm,zeta電位分別為-33.83±0.35 mV、-27.80±0.77mV。體外釋放均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型。腫瘤細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

11、表明,與多帕菲(R)相比,兩種脂質(zhì)納米混懸劑的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)。對(duì)于主動(dòng)靶向制劑組,tLNS對(duì)B16細(xì)胞的IC50值明顯低于pLNS的IC50值(P＜0.05),而對(duì)于HepG2細(xì)胞的IC50值沒(méi)有顯著性差異,細(xì)胞毒性相當(dāng)。結(jié)果說(shuō)明,對(duì)于細(xì)胞表面高表達(dá)葉酸受體的腫瘤細(xì)胞,由于其表面大量的葉酸受體與連有葉酸的載體結(jié)合,使抗癌藥物可以更多的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,發(fā)揮抑瘤作用,因此,體外抑瘤中,與pLNS相比,tLNS顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。藥效學(xué)

12、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pLNS組與Duopafei(R)組相比具有明顯的抑瘤效果,tLNS組又有更好的治療效果。tLNS組與Duopafei(R)組比較,瘤體積減小明顯(P＜0.01),表明制劑組與多帕菲(R)注射液組相比療效更好。同時(shí)小鼠體重變化相差明顯(p＜0.01),N.S組、Blank-pLNS組、Blank-tLNS組、pLNS組和tLNS組,小鼠體重均有明顯增長(zhǎng),唯有注射液多帕菲(R)組小鼠體重下降。由于體重變化是判斷制劑毒性的一個(gè)

13、重要指標(biāo),因此上述結(jié)果說(shuō)明各多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑的毒性作用遠(yuǎn)小于市售注射液多帕菲,具有臨床用藥的價(jià)值。小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)證明LNS、pIMS與tLNS脂質(zhì)納米混懸劑靜脈注射給藥后,均可延長(zhǎng)藥物在小鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間。對(duì)三種納米混懸劑的瘤內(nèi)靶向性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示,pLNS組瘤的總靶向效率Te由多帕菲(R)注射液組的5.22%提高到5.67%(1.09倍),其相對(duì)攝取率re和瘤內(nèi)峰濃度Ce分別為5.22和1.02;tLNS組瘤的總靶向

14、效率Te由多帕菲(R)注射液組5.22%提高到6.40%(1.23倍),是長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)納米混懸劑的1.13倍,其相對(duì)攝取率re和瘤內(nèi)峰濃度Ce分別為5.92和1.17。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了,與pLNS相比,多西他賽tLNS有更好的腫瘤靶向效率,可更明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　綜上所述,本研究制備的三種多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑是一種多西他賽新劑型,制備工藝簡(jiǎn)單可行,重現(xiàn)性好,適合產(chǎn)業(yè)化,改善了多西他賽的溶解度,增強(qiáng)了其抗腫瘤作用同時(shí)降低了