共載神經(jīng)酰胺—多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑協(xié)同抗腫瘤研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，居發(fā)展中國家致死率首位，抗癌形勢嚴(yán)峻。由于腫瘤發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性和治療的困難性，聯(lián)合用藥應(yīng)運(yùn)而生并成為當(dāng)前臨床癌癥治療中最重要的手段之一。聯(lián)合用藥能夠發(fā)揮藥物治療協(xié)同作用、提高腫瘤治療效果并降低毒副作用。在聯(lián)合用藥中，選擇兩種或兩種以上具有協(xié)同作用的藥物是治療成功的關(guān)鍵。將生物活性分子與化療藥物聯(lián)用可在不增加毒副作用的基礎(chǔ)上提高藥物療效，在聯(lián)合抗腫瘤中顯示出巨大發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景。
　　在眾多

2、生物活性分子中，神經(jīng)酰胺（Ceramide，CE）作為一種新型生物活性分子引起廣泛關(guān)注。CE是人體自身存在的一類鞘磷脂，能介導(dǎo)細(xì)胞的生長、分化、凋亡等一系列生理活動(dòng)，同時(shí)能夠提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，具有良好的聯(lián)合抗腫瘤應(yīng)用潛力。然而，目前尚沒有CE與抗腫瘤藥物協(xié)同作用的系統(tǒng)性研究，因此，基于CE的聯(lián)合抗腫瘤方法具有巨大的研究意義和應(yīng)用前景。
　　本課題旨在探索基于CE的聯(lián)合抗腫瘤方案，確定CE與臨床常用抗腫瘤藥物多西他賽(

3、Docetaxel，DTX)聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制;開發(fā)一種共遞送CE和DTX的新型“twoinone”脂質(zhì)納米混懸劑(Lipidbasednanosuspension，LNS)體系，提高CE和DTX溶解度以及二者共遞送效率，協(xié)同提高CE和DTX的抗腫瘤作用，利于未來癌癥的治療。研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.基于神經(jīng)酰胺的聯(lián)合抗腫瘤方案篩選
　　為更大程度上探索CE與化療藥物聯(lián)用的潛力，本部分通過噻唑蘭比色法(4，5-Dim

4、ethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT)首次系統(tǒng)考察了CE與臨床上廣泛應(yīng)用的三種化療藥物:DTX、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)和多柔比星(Doxorubicin，DOX)聯(lián)用后在四種常見腫瘤細(xì)胞:黑色素瘤細(xì)胞(B16)、卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和肝癌細(xì)胞(HepG2)中的細(xì)胞毒性;通過聯(lián)用指數(shù)(CombinationIndex，CI)

5、法評價(jià)聯(lián)用藥物間的協(xié)同性，篩選出與CE聯(lián)用的最佳化療藥物并對聯(lián)用方案進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)給藥組相比，能顯著性提高藥物的細(xì)胞毒性(p＜0.01);CE與DTX在B16和MCF-7細(xì)胞上的聯(lián)用指數(shù)最低(B16:CI=0.47;MCF-7:CI=0.71)，具有最強(qiáng)協(xié)同作用;聯(lián)用比例對藥物間協(xié)同作用影響較大，當(dāng)CE與DTX以摩爾比例0.5∶1給藥時(shí)可獲得最低CI值(B16:CI=0.31;MCF-7:CI=0.48);給藥

6、順序?qū)f(xié)同作用無明顯影響，適合同時(shí)給藥。綜上，當(dāng)CE和DTX以摩爾比0.5∶1同時(shí)給藥時(shí)，在B16和MCF-7細(xì)胞上可獲得最強(qiáng)協(xié)同效果，為最佳聯(lián)用方案。
　　2.神經(jīng)酰胺-多西他賽協(xié)同抗腫瘤機(jī)制研究
　　CE和DTX協(xié)同機(jī)制尚無任何報(bào)道，為更好的驗(yàn)證CE聯(lián)用DTX(CE+DTX)的協(xié)同作用，為CE+DTX聯(lián)用方案提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)，本部分分別從細(xì)胞凋亡，Caspase-3活性的激活，細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞骨架破壞四個(gè)方面探索CE

7、和DTX產(chǎn)生協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。在機(jī)制闡明基礎(chǔ)上，通過小鼠黑色素瘤(B16)荷瘤小鼠考察CE+DTX體內(nèi)藥效，評價(jià)其體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CE可靶向破壞細(xì)胞骨架中的微絲結(jié)構(gòu)，促進(jìn)微絲聚合和Caspase-3釋放;DTX則可靶向破壞細(xì)胞骨架中的微管結(jié)構(gòu)，促進(jìn)微管聚合并抑制解聚;與單獨(dú)用藥組相比，CE+DTX可協(xié)同性破壞整體細(xì)胞骨架，最終使細(xì)胞凋亡比例、有絲分裂中G2/M期細(xì)胞比例均顯著性升高(p＜0.01)。該發(fā)現(xiàn)為C

8、E和DTX的聯(lián)用提供了良好的理論基礎(chǔ)，有利于對CE+DTX進(jìn)行深入研究。體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CE+DTX組腫瘤抑瘤率高達(dá)64.92±0.22％，顯著性高于CE組腫瘤抑瘤率（7.07±3.07％，p＜0.01）和DTX組腫瘤抑瘤率（46.14±4.27％，p＜0.01），表明CE+DTX共同給藥在荷瘤小鼠體內(nèi)具有良好協(xié)同抑瘤效果，為CE+DTX聯(lián)合應(yīng)用奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.神經(jīng)酰胺-多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑藥物含量測定方法建立

9、
　　采用高效液相色譜法(HPLC)測定共載CE和DTX的脂質(zhì)納米混懸劑(CE+DTX-LNS)中DTX的含量，并對方法學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明HPLC法簡便快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能準(zhǔn)確測定DTX含量。
　　采用熒光分光光度法測定4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑(NBD)熒光標(biāo)記的CE+DTX-LNS中NBD-CE的含量，并對方法學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明熒光分光光度法靈敏度極高、選擇性好、操作簡便能準(zhǔn)確測定CE含量。

10、
　　4.神經(jīng)酰胺-多西他賽脂質(zhì)納米混懸劑協(xié)同抗腫瘤研究
　　CE和DTX水溶性均較差，嚴(yán)重限制了其體內(nèi)應(yīng)用。CE尚無上市制劑，而目前上市的DTX劑型如多帕菲(R)和泰索帝(R)，含有Tween-80和乙醇等助溶劑易導(dǎo)致超敏反應(yīng)、腎毒性等不良作用。因此本課題采用高壓均質(zhì)法制備安全無毒的CE+DTX-LNS，采用冷凍干燥技術(shù)制備CE+DTX-LNS凍干制劑;透射電鏡觀察粒子外觀形態(tài)，激光粒度分布與電勢分析儀考察其粒徑和電位;動(dòng)

11、態(tài)膜透析法考察體外釋藥行為;MTT法和Caspase-3活性檢測法考察CE+DTX-LNS體外協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞作用;小動(dòng)物活體成像技術(shù)考察CE+DTX-LNS的體內(nèi)分布;熒光倒置顯微鏡和流式分析儀評價(jià)課題制備的“twoinone”LNS體系(CE+DTX-LNS)在共遞送CE和DTX至同一腫瘤細(xì)胞中的優(yōu)勢;通過B16荷瘤小鼠驗(yàn)證體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤療效，并考察協(xié)同抗腫瘤作用與共遞送效率之間關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過最佳處方和制備工藝

12、制得的CE+DTX-LNS形態(tài)呈規(guī)則圓形，粒徑為108.1±3.42nm，電位為-23.25±0.49mV，平均載藥量為11.32±0.11％;制成凍干制劑后穩(wěn)定性得到大幅提升，可在4℃條件下穩(wěn)定儲(chǔ)存3個(gè)月;CE+DTX-LNS具有良好緩釋功能，且CE和DTX的釋放相互獨(dú)立;與CE(或DTX)溶液組相比，CE-LNS（或DTX-LNS）的細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)(p＜0.01)，說明LNS能顯著提高CE或DTX的遞送效率;CE+DTX-LNS體

13、外激活Caspase-3活性能力顯著強(qiáng)于CE-LNS(p＜0.01)和DTX-LNS(p＜0.01)，證明其具有協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力;體外共遞送實(shí)驗(yàn)中，CE+DTX-LNS能夠?qū)E和DTX高效遞送至同一腫瘤細(xì)胞，CE、DTX和細(xì)胞共定位良好，而經(jīng)CE-LNS和DTX-LNS的物理混合物(CE-LNS+DTX-LNS)處理后，細(xì)胞分群現(xiàn)象明顯，說明CE和DTX共遞送效率差;CE+DTX-LNS與CE-LNS+DTX-LNS的細(xì)胞攝取均呈

14、時(shí)間依賴性，其中CE+DTX-LNS最高攝取率為72.6±4.2％，顯著高于CE-LNS+DTX-LNS的64.5±2.7％(p＜0.05)，說明“twoinone”LNS體系中CE能夠促進(jìn)載體與細(xì)胞膜相互作用，增強(qiáng)載體攝取能力;小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)表明，CE+DTX-LNS與溶液組相比能夠有效延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間并被動(dòng)靶向遞送至腫瘤組織，減少正常組織分布;體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)中，CE+DTX-LNS抑瘤率高達(dá)93.94±2.77％，顯著高于單獨(dú)給藥

15、的CE-LNS（33.22±5.43％，p＜0.01）和DTX-LNS（69.32±3.65％，p＜0.01）以及市售多帕菲(R)（59.91±4.54％，p＜0.01），證明了CE+DTX-LNS體內(nèi)良好的協(xié)同抑瘤效果;同時(shí)顯著高于CE-LNS+DTX-LNS抑瘤率（84.94±3.76％，p＜0.05），說明CE和DTX共遞送至同一腫瘤細(xì)胞是發(fā)揮該協(xié)同抗腫瘤作用的基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究首次系統(tǒng)考察了CE與不同抗腫瘤藥物的