分子伴侶協(xié)助的基因工程藥物重組人干擾素-γ體外重折疊研究.pdf

1、首先建立了rhIFN-γ的生物活性檢測方法,測定細胞人為羊膜細胞Wish株,攻擊病毒為水泡性口炎病毒(VSV)株.對以細胞病變(CPE)效應為基礎的結晶紫染色法進行了條件優(yōu)化,考察了結晶紫染液的用量及作用時間、溶媒提取時間、孔板效應及邊緣效應等條件的影響.結果表明結晶紫染液的加入量在30~50μL之間較適宜,同時應當與染液作用時間相關聯(lián),用量大時作用時間相對減少;有機溶液脫色30min后測定較好,此時細胞核中的結晶紫已被提取完全,而結晶

2、紫在脫色液中尚能穩(wěn)定存在;為了最大程度利用微量板,同時考慮到邊緣效應和孔板效應的存在,第1和第12列加細胞對照,第6和第7列加病毒對照.其次在搖瓶的基礎上進行了小分子伴侶sht GroEL 191-345的發(fā)酵罐培養(yǎng).操作條件為:初始葡萄糖濃度為5g/L,接種量2.5％,轉速為350r/min,通氣量200L/h,裝液量2.1L/3.7L,發(fā)酵溫度33℃.經過超聲波破碎、高速離心分離、親和層析純化及脫鹽后得到sht GroEL 191-

3、345 216.2mg/L發(fā)酵液.然后考察了游離和固定化小分子伴侶sht GroEL 191-345對rhIFN-γ體外重折疊重復的作用.sht GroEL 191-345的加入有效地促進了rhIFN-γ的復性,用含脲1.0mol/L,pH7.7的復性緩沖液將rhIFN-γ包涵體稀釋至初始蛋白濃度100μg/mL,15℃復性4h后,加入sht GroEL 191-345的一組(sht GroEL 191-345同rhIFN-γ的摩爾比為

4、2:1),蛋白效率提高了2.2倍,總活性提高了近3倍;將小分子伴侶固定化在NHS-activated Sepharose Fast Flow凝膠后,不但能重復利用,而且進一步提高了rhIFN-γ復性效率,在初始蛋白濃度為400μg/mL時,仍使蛋白質收率達到46.29％和比活達到9.05×10<'6>IU/mg.最后初步研究了人工分子伴侶(CTAB+β-CD)系統(tǒng)對rhIFN-γ體外重折疊復性的作用.實驗結果表明,人工分子伴侶系統(tǒng)也可以