基因重組人干擾素α脂質(zhì)體凝膠劑的制備及質(zhì)量研究.pdf

1、本研究以脂質(zhì)體藥物的包封率、穩(wěn)定性為評價指標，通過單因素考察和正交設(shè)計法篩選干擾素脂質(zhì)體的最佳處方；采用優(yōu)化處方及工藝制備干擾素脂質(zhì)體混懸液，選用適當基質(zhì)為賦形劑，研制使用方便、穩(wěn)定高效的干擾素脂質(zhì)體凝膠劑；考察制劑的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性及皮膚刺激性；考察干擾素脂質(zhì)體凝膠的體外和體內(nèi)透皮擴散情況，并與臨床應(yīng)用的干擾素凝膠劑進行比較，探討脂質(zhì)體對藥物透皮擴散的影響；建立皮膚單純皰疹病毒感染的豚鼠模型，進行初步的藥物抗病毒試驗，探討干擾素脂質(zhì)體

2、凝膠劑的藥效。 方法： 1制備干擾素脂質(zhì)體混懸液選用薄膜超聲法、薄膜+高壓勻化法分別制備干擾素脂質(zhì)體，比較其制備工藝和制備質(zhì)量的差異。通過單因素考察，確定對干擾素脂質(zhì)體包封率和穩(wěn)定性影響較大的因素，結(jié)合正交試驗設(shè)計，篩選干擾素脂質(zhì)體的優(yōu)化處方，制備干擾素脂質(zhì)體混懸液。采用凝膠柱過濾法和超濾膜過濾法分離、純化脂質(zhì)體，ELISA法測定干擾素含量，比較兩種分離方法對脂質(zhì)體包封率檢測的影響。 2 制備干擾素脂質(zhì)體凝膠劑并考

3、察其理化性質(zhì)以干擾素在離體大鼠皮膚中的滯留量為考察指標，選用不同濃度的卡波姆為凝膠基質(zhì)，確定其配方并制備干擾素脂質(zhì)體凝膠劑；研究干擾素脂質(zhì)體凝膠劑在離心試驗、光照試驗、溫度影響試驗、濕度影響試驗等條件下，制劑性狀、藥物含量等各項理化指標的變化，初步考察其穩(wěn)定性。 3 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的透皮試驗以SD大鼠為試驗對象，進行離體及在體皮膚透皮試驗，考察干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的透皮效果。 4 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的皮膚刺激性試驗以家

4、兔為試驗對象，在其背部皮膚分別涂抹干擾素脂質(zhì)體凝膠和干擾素凝膠，并于用藥后12、24、48、72h分別觀察皮膚變化情況，研究干擾素脂質(zhì)體凝膠劑對家兔皮膚的刺激性。 5 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的抗病毒試驗以Vero細胞為繁殖細胞，在37℃、5％CO<,2>孵箱中進行單純皰疹病毒的增殖；采用空斑形成試驗，測定單純皰疹病毒的滴度；以白色雄性豚鼠為試驗對象，制備皮膚單純皰疹病毒感染的豚鼠模型，于第3天開始，分別給予干擾素脂質(zhì)體凝膠劑和市售干

5、擾素凝膠進行治療，觀察試驗區(qū)皮膚的癥狀，比較病變的痊愈時間及累積計分，考察干擾素脂質(zhì)體凝膠的藥效。 結(jié)果： 1干擾素脂質(zhì)體混懸液的制備采用薄膜超聲法制備的干擾素脂質(zhì)體混懸液在室溫和4℃冰箱放置1個月后，有凝聚、分層現(xiàn)象；而用薄膜+高壓勻化法制備的干擾素脂質(zhì)體在放置1個月后，仍呈均勻、半透明的乳白色溶液狀態(tài)，表現(xiàn)出較好的制劑穩(wěn)定性。采用薄膜+高壓勻化法制備脂質(zhì)體，在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定磷脂與膽固醇比例、干擾素用量、水化溶

6、液用量與十八胺用量等四個因素，每個因素各設(shè)三個水平，正交設(shè)計試驗結(jié)果顯示，各因素對包封率影響的大小順序為：十八胺用量一水化溶液用量一磷脂與膽固醇比例一干擾素用量。最后確定干擾素脂質(zhì)體的優(yōu)化處方組合為磷脂：膽固醇4:1，干擾素300萬U，十八胺60 mg，PBS 60 ml。 采用凝膠柱過濾法與超濾膜過濾法分離純化脂質(zhì)體，測得的藥物包封率基本無差別。電子顯微鏡觀察，優(yōu)化處方制備的脂質(zhì)體呈球形或類圓形，大小均一，表面光滑、規(guī)整，分散

7、性良好。采用凝膠柱過濾結(jié)合ELISA法測定干擾素脂質(zhì)體，平均包封率為64.64％，激光散射粒度分析儀測定平均粒徑為107 nm，表面Zeta電位平均>25 mv。分別于制備后1周、1個月、3個月后取樣觀察，存放于4℃冰箱中的脂質(zhì)體無分層、沉淀及顏色變化，其粒徑和包封率變化很小(P>0.05)，而存放于室溫下的脂質(zhì)體3個月后發(fā)現(xiàn)有少量白色沉淀，且粒徑和包封率變化較大(P<0.01)。 2 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的制備分別制備含0.5％

8、、1.0％、1.5％卡波姆的干擾素脂質(zhì)體凝膠，凝膠外觀呈乳白色，膠體細膩、均勻，pH值為6.0～6.5。穩(wěn)定性試驗表明，光照和濕度變化對凝膠的質(zhì)量穩(wěn)定性影響較小，而溫度變化對其影響較大。離體大鼠皮膚試驗結(jié)果表明，含0.5％卡波姆的干擾素脂質(zhì)體凝膠在皮膚中的干擾素滯留量最多。 3 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的大鼠皮膚滲透試驗以市售的干擾素凝膠為對照，離體和在體大鼠皮膚透皮試驗結(jié)果均顯示，使用本研究制備的干擾素脂質(zhì)體凝膠劑，干擾素在皮膚中的

9、滯留量明顯高于對照組(P<0.01)。 4 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的皮膚刺激性試驗家兔在體皮膚刺激性試驗表明，使用干擾素脂質(zhì)體凝膠劑和市售的干擾素凝膠，家兔背部皮膚均未出現(xiàn)紅斑、水腫等現(xiàn)象，表明制備的干擾素脂質(zhì)體凝膠劑對皮膚無刺激性。 5 干擾素脂質(zhì)體凝膠劑的抗單純皰疹病毒試驗單純皰疹病毒(HSV-1)感染Vero細胞后很快增殖，用超低溫反復(fù)凍融法收獲病毒，采用空斑單位形成試驗測定病毒上清液的滴度為1.5×10<'7>PFU

10、/ml。豚鼠感染病毒后第2天可見皮膚紅腫現(xiàn)象，第3天出現(xiàn)1～2個小皰疹，第4天病變發(fā)展至高峰。比較4組豚鼠皮膚的病變積分和痊愈時間，干擾素脂質(zhì)體凝膠組和干擾素凝膠組病變積分均小于病毒感染組和基質(zhì)對照組，病毒感染的痊愈時間大大縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。干擾素脂質(zhì)體凝膠組與干擾素凝膠組相比，病變積分小，痊愈時間短，療效有顯著性差異(p<0.01)。 結(jié)論： 采用薄膜+高壓勻化法能夠成功地制備干擾素脂質(zhì)體，用優(yōu)化