小分子伴侶的制備及其協(xié)助基因工程蛋白體外重折疊的初步研究.pdf

1、首先根據(jù)載體的特性,我們選擇了大腸桿菌BL21作為宿主細(xì)胞.在將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后,根據(jù)小分子伴侶的分子量18kDa和其六聚組氨酸尾能夠親和吸附到Ni-NTA的特性進(jìn)行了初步鑒定,并根據(jù)小分子伴侶表達(dá)量的大小選定了菌種.然后對培養(yǎng)基的種類、組成和培養(yǎng)條件中各項(xiàng)主要因素進(jìn)行了考察.在基本培養(yǎng)基的選擇時(shí),發(fā)現(xiàn)攜帶小分子伴侶基因的工程菌在含有無機(jī)鹽和碳源的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠顯著提高小分子伴侶的表達(dá)量,在確定M9為基本培養(yǎng)基之后,對其主要成分

2、進(jìn)行了優(yōu)化,同時(shí),考察了發(fā)酵溫度、供氧量、誘導(dǎo)條件等對目標(biāo)蛋白表達(dá)量的影響,在搖瓶培養(yǎng)中將發(fā)酵產(chǎn)量提高到了556.3mg/L.在轉(zhuǎn)速為6000rpm的條件下收集發(fā)酵液中的細(xì)胞,用緩沖液將其重新懸浮后,超聲波破碎,離心取上清,根據(jù)小分子伴侶N末端的His<,6>-Tag的特性進(jìn)行了Ni-NTA親和層析.在層析過程中,對其吸附和洗脫進(jìn)行了咪唑梯度的考察,實(shí)現(xiàn)了一步純化.純化后的產(chǎn)品用凝膠層析進(jìn)行了純度檢測,并用MALDI-TOF-MS驗(yàn)證了