LR3-IGF-I基因工程菌的構(gòu)建、表達(dá)及純化.pdf

1、IGF-Ⅰ是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，是由70個(gè)氨基酸組成的單鏈堿性多肽，主要由肝臟合成、分泌，具有胰島素樣合成代謝作用和促生長(zhǎng)作用;LR3-IGF-Ⅰ在IGF-Ⅰ N端添加了十三個(gè)氨基酸，并且把IGF-Ⅰ的第三位Glu(E)用Arg(R)代替，在1992年由Francis GL等人在大腸桿菌中高效表達(dá)， LR3-IGF-Ⅰ比IGF-Ⅰ活性高，體內(nèi)半衰期也延長(zhǎng)，當(dāng)前用LR3-IGF-Ⅰ做醫(yī)學(xué)研究、延緩衰老、健美等，有巨大的市場(chǎng)需求。但

2、國(guó)際上尚無(wú)廉價(jià)的LR3-IGF-Ⅰ產(chǎn)品，應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)LR3-IGF-Ⅰ將會(huì)推動(dòng)LR3-IGF-Ⅰ的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用。
　　本論文分三部分:
　　第一部分:利用基因克隆方法設(shè)計(jì)并合成引物，利用實(shí)驗(yàn)室保存的IGF-Ⅰ表達(dá)質(zhì)粒pExSecⅠ-IGF-Ⅰ在體外經(jīng)PCR擴(kuò)增得到重組表達(dá)質(zhì)粒pExSecⅠ-LR3-IGF-Ⅰ，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ecoli.BL21進(jìn)行篩選，得到穩(wěn)定的LR3-IGF-Ⅰ原核表達(dá)系統(tǒng)。將基因工程菌在37℃

3、培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后，LR3-IGF-Ⅰ以包涵體形式大量表達(dá)。
　　第二部分:通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)對(duì)LR3-IGF-Ⅰ在基因工程菌中的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化;優(yōu)化后的表達(dá)條件下所得包涵體中目的蛋白表達(dá)量最高為46.97％，五升發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)可得到含目的蛋白20％左右的包涵體13g。
　　第三部分:將發(fā)酵所得包涵體進(jìn)行變性，對(duì)不同的復(fù)性方法進(jìn)行比較，確定一步稀釋法回收率較高;對(duì)不同的純化途徑

4、進(jìn)行了比較，確定通過(guò)Sephadex G-50和SP Sepharose Fast Flow兩步純化，可得到電泳純的目的蛋白。純化所得目的蛋白經(jīng)反相HPLC分析純度達(dá)98％，CCK-8法測(cè)定具有促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠NIH-3T3成纖維細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。
　　本論文初步得到一條在回收率和成本核算方面均具有可行性的LR3-IGF-Ⅰ規(guī)?；a(chǎn)工藝路線，下一步的工作目標(biāo)是對(duì)已建立的工藝路線進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，為L(zhǎng)R3-IGF-Ⅰ的產(chǎn)業(yè)化