產(chǎn)MTSase、MTHase融合酶菌株的構建及其表達.pdf

1、海藻糖是由兩分子葡萄糖通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性二糖，對生物體具有良好的非特異性保護作用，被廣泛的應用于藥品，食品，化妝品中，具有廣闊的應用前景。目前生產(chǎn)海藻糖多為提取法，但產(chǎn)率低，遠不能滿足現(xiàn)市場要求。本文以麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）、麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）為研究對象，通過插入不同的連接肽以及不同的融合順序，構建產(chǎn)MTSase, MTHase的融合酶菌株，并進行表達分析。
　　本研究

2、主要內(nèi)容包括：⑴氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter oxydans）經(jīng)過發(fā)酵驗證后，證明其菌株中含有海藻糖合成相關酶MTSase和MTHase。根據(jù)同源比對設計簡并引物，通過基因工程手段，分別得到了mtsase基因序列全長2328 bp，編碼775個氨基酸，mthase基因序列全長1770 bp，編碼589個氨基酸。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)分析顯示，與Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3的核苷酸序列一致性均

3、為87％。⑵設計無縫克隆引物，通過PCR得到目的基因mtsase和mthase，分別與雙酶切后的表達載體pET-22b進行連接，實現(xiàn)了MTSase和MTHase在大腸桿菌中的表達。重組MTSase和重組MTHase的酶活力分別為17.85 U/mL和15.16 U/mL。在40℃，pH7.0的條件下，以4%的直鏈淀粉為底物，兩種酶聯(lián)合作用反應24 h，海藻糖的轉(zhuǎn)化率為45.87%。⑶選擇(GGGGS)2和(EAAAK)3作為連接肽，并設

4、計了 mtsase-mthase以及mthase-mtsase兩種連接順序，成功構建了4種產(chǎn)MTSase和MTHase融合酶的菌株。重組融合酶菌株經(jīng)過誘導表達，SDS-PAGE均檢測到融合蛋白，分子量大小約為160KDa。在催化直鏈淀粉反應中，4種融合酶都表現(xiàn)出了雙酶的功能，其中，融合酶SP2H具有較高的酶活力為11.53U/mL。⑷通過對發(fā)酵培養(yǎng)基單因素條件的優(yōu)化以及酶學性質(zhì)的研究，得到了適合該重組融合酶的發(fā)酵培養(yǎng)基M9-ZJ-LM-