長鏈非編碼RNA-MALAT1在糖尿病性視網膜微血管病變過程的調控作用研究.pdf

1、目的：探討長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉移相關轉錄物1(long non codingRNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1,lncRNA-MALAT1)在糖尿病性視網膜微血管病變中的作用及其機制。
　　方法：⑴單次腹腔注射鏈脲霉素(Streptozocin，STZ)構建大鼠糖尿病模型，RT-PCR檢測糖尿病大鼠、野生型大鼠的視網膜以及先天糖尿病小鼠、野生型小

2、鼠視網膜中MALAT1的表達。細胞實驗，采用原位雜交技術檢測猴視網膜血管內皮細胞(RF/6A)的MALAT1的表達情況。⑵野生型大鼠及糖尿病大鼠眼內注射MALAT1 shRNA或Scr shRNA腺病毒，RT-PCR驗證MALAT1的表達下調。采用視覺電生理(ERG)檢測MALAT1的下調對大鼠視覺功能的影響。采用TUNEL法檢測MALAT1下調對大鼠視網膜細胞凋亡的影響。采用視網膜胰酶消化及糖原雪夫染色法檢測MALAT1下調對視網膜周

3、細胞缺失及無細胞血管形成的影響。采用伊凡氏藍-白蛋白染色法檢測MALAT1下調對糖尿病大鼠視網膜血管滲漏的影響。采用Western Blotting法檢測各組大鼠視網膜中炎癥因子細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達情況，以探討MALAT1下調對糖尿病大鼠的視網膜炎癥反應影響。⑶小RNA干擾的方法下調RF/6A細胞中MALAT1的表達后，給予高糖（或H2O2）刺激，采用

4、MTT檢測RF/6A細胞的活力;采用Hoechst、JC-1、PI與臺盼藍染色檢測細胞的凋亡或死亡情況，以探究MALAT1是否影響高糖誘導的細胞凋亡。VEGF或TNF-α誘導RF/6A細胞遷移和成管，采用細胞劃痕法及基質毛細管發(fā)生實驗分別檢測MALAT1下調對細胞遷移和成管能力的影響。⑷采用Western blotting法來檢測在高糖刺激和MALAT1下調處理后RF/6A細胞中p38、JNK及ERK1/2的激活情況，探究MALAT1是

5、否通過絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路調控視網膜內皮細胞的功能。
　　結果：①MALAT1在糖尿病大鼠和小鼠視網膜中表達顯著上調。原位雜交結果顯示MALAT1在RF/6A細胞核內大量表達。②RT-PCR結果顯示眼內注射MALAT1 shRNA腺病毒的糖尿病大鼠視網膜中MALAT1表達水平下調，注射Scr shRNA腺病毒的沒有明顯改變。MALAT1表達下調后能

6、減輕糖尿病導致視功能下降及視網膜細胞的凋亡;改善周細胞缺失、無細胞血管的形成及血管滲漏;減少視網膜中ICAM-1、VEGF和TNF-α等炎性因子的表達。③高糖或H2O2處理RF/6A細胞后，細胞活力下降，下調MALAT1后，活細胞的活力進一步降低。VEGF或TNF-α處理后RF/6A細胞遷移與成管能力顯著增加，MALAT1的下調則降低細胞遷移與成管能力。④MALAT1下調導致p38磷酸化水平下降，但對ERK1/2或JNK1/2磷酸化水平