基于蛋白質(zhì)組學(xué)方法的金納米粒子分子生物相容性機(jī)理研究.pdf

1、金納米粒子具有許多優(yōu)良的理化特性，因而在醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷、藥物載體、腫瘤治療和基因診療等生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。由于目前還未形成對納米材料安全性評價的標(biāo)準(zhǔn)體系，納米材料的安全性問題越來越得到各界的重視。為了使納米材料能更安全有效的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，關(guān)于它們對細(xì)胞以及機(jī)體的健康和生物學(xué)功能的影響以及作用機(jī)理的研究也就顯得越來越重要。目前，關(guān)于金納米顆粒分子生物相容性的相關(guān)研究還很少。 本論文的研究目的是在金納米顆粒

2、與細(xì)胞相互作用的檢測基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，從蛋白質(zhì)水平上對20nm金納米粒子對人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF-f）的分子生物相容性進(jìn)行機(jī)理研究。通過探索研究納米材料與機(jī)體相互作用的機(jī)理的新途徑，為建立基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的納米材料分子生物相容性評價的新方法打下基礎(chǔ)。 本論文的具體工作如下： 1、采用檸檬酸鈉還原氯金酸法摸索并制備了20 nm納米金溶膠。采用紫外分光光度計和透射電鏡對制備的納米金溶膠進(jìn)行表征

3、。此外，對不同水溶劑制備納米金溶膠結(jié)果進(jìn)行了初步探討，并對后續(xù)實驗的納米金溶膠尺寸選擇進(jìn)行了調(diào)研。 2、采用MTT實驗獲得了HDF-f細(xì)胞活力代謝標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過制備不同濃度的20 nm納米金溶液，首先應(yīng)用MTT實驗評價了10-300μM納米金處理細(xì)胞72 h的細(xì)胞毒性，并考察了特定濃度（200μM）的納米金作用細(xì)胞1、4、8 h后的細(xì)胞毒性；然后采用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究了200μM，20 nm納米金處理細(xì)胞1、4、8 h后對細(xì)胞周

4、期和后期凋亡的影響。MTT實驗和流式細(xì)胞儀的結(jié)果顯示，200μM，20 nm納米金對細(xì)胞無毒性作用。 3、應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（二維差異凝膠電泳（2D-DIGE）實驗和質(zhì)譜（Mass spectrometry）實驗）考察了200μM納米金，作用1、4、8h后的細(xì)胞發(fā)生差異表達(dá)的蛋白情況。采用蛋白免疫印跡實驗（Western blot）對實驗結(jié)果中挑選的兩個蛋白進(jìn)行了初步驗證。通過采用one-way ANOVA差異點篩選原則，獲得了

5、細(xì)胞在三個時間點都發(fā)生差異表達(dá)蛋白質(zhì)點40個。應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對2D-DIGE獲得的40差異表達(dá)蛋白質(zhì)點進(jìn)行了鑒定，最終鑒定出36個蛋白點，按照功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行分類，其中有功能蛋白29個，結(jié)構(gòu)蛋白7個。29個功能蛋白分別屬于23種不同蛋白。Western blot結(jié)果顯示，兩個蛋白表達(dá)情況與2D-DIGE結(jié)果一致。 4、應(yīng)用Cluster和TreeView軟件對200μM，20nm納米金作用HDF-f1、4、8 h后三個實驗組

6、發(fā)生的40個差異表達(dá)蛋白進(jìn)行層次聚類分析，對蛋白表達(dá)模式隨時間變化的規(guī)律進(jìn)行分類和研究。所有差異表達(dá)蛋白在三個時間點都上調(diào)表達(dá)的有9個；都下調(diào)表達(dá)的13個；既有上調(diào)又有下調(diào)表達(dá)的18個。所有差異表達(dá)蛋白的可分為8種表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜鑒定出的相同或功能相似蛋白，大部分都聚類在同一表達(dá)模式中。 5、應(yīng)用GoSurfer。軟件對200μM，20 nm納米金作用HDF-f1、4、8 h后三個實驗組發(fā)生差異表達(dá)的23種功能蛋白進(jìn)行GO

7、功能分類分析，對差異表達(dá)的蛋白按照生物學(xué)過程（Biologicalprocess）、分子功能（Molecular function）、細(xì)胞組分（Cellular component）結(jié)構(gòu)層級進(jìn)行功能分類研究。根據(jù)對所有差異表達(dá)的功能蛋白進(jìn)行生物學(xué)過程分類研究，發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白富集的生物學(xué)過程主要涉及細(xì)胞過程和生理過程；分子功能主要涉及結(jié)合和催化活性；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞和細(xì)胞器。通過GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白涉及的生物學(xué)功能廣泛，這提

8、示納米金可能對細(xì)胞有廣泛作用。 6、應(yīng)用GenMAPP生物學(xué)途徑分析軟件和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析平臺對200μM，20 nm納米金作用HDF-f1、4、8 h后三個實驗組發(fā)生差異表達(dá)的23種功能蛋白參與的生物學(xué)途徑和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。GenMAPP分析結(jié)果顯示：23種差異蛋白共涉及21個MAPPs；對其中17個“HS Contributed MAPPs”涉及的生物學(xué)途徑進(jìn)行了詳