基于生物質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本文的主要貢獻(xiàn)為兩方面:1）建立了糖基化肽段高通量鑒定的技術(shù)平臺(tái)。2）提出了整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)篩選肝癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的新方法。論文分為兩大部分，第一部分（第2-5章）是糖基化肽段的鑒定:針對(duì)糖肽譜圖的解析，設(shè)計(jì)了糖肽譜圖解析平臺(tái)GRIP，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)際復(fù)雜樣本中糖肽分子的表征為本論文的重點(diǎn)。第二部分（第6章）是整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)挖掘肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物。
　　蛋白翻譯后修飾已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)方向，而糖基

2、化修飾是最重要的蛋白翻譯后修飾之一。糖蛋白廣泛分布于各種組織的細(xì)胞膜表面和體液中，目前已知哺乳動(dòng)物中超過(guò)50％的蛋白是糖蛋白，此外蛋白上的聚糖以及糖鏈結(jié)構(gòu)的變化參與了腫瘤、代謝性疾病、心腦血管疾病、先天性遺傳病等重大疾病的發(fā)生發(fā)展。由于其重要性，糖蛋白鑒定的技術(shù)問(wèn)題成為焦點(diǎn)，主要涉及揭示生物樣本中糖蛋白的豐度、種類、糖基化位點(diǎn)，以及糖鏈天線結(jié)構(gòu)的組成、序列、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)，這幾個(gè)方面在難度上依次增高。目前還沒(méi)有一款成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)軟

3、件可以直接移植到糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究上，而現(xiàn)有的糖蛋白質(zhì)組學(xué)軟件均處于雛形階段，均存在通量低和假陽(yáng)性高的問(wèn)題。因此，亟待發(fā)展一套基于質(zhì)譜的糖肽譜圖解析方法，以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本中糖肽分子高通量和高可信度的鑒定。
　　糖肽分子在不同類型的質(zhì)譜中會(huì)呈現(xiàn)不同的碎裂模式，進(jìn)而產(chǎn)生差別較大的糖肽譜圖。對(duì)不同碎裂模式的充分挖掘有助于糖肽譜圖的正確識(shí)別。在高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)中，糖肽分子的糖鏈和肽段都會(huì)發(fā)生碎裂;而低能碰撞誘導(dǎo)解離(CID)中，糖肽

4、分子的碎裂只發(fā)生在糖鏈上，從而使糖肽譜圖更加簡(jiǎn)化。這個(gè)現(xiàn)象在LTQ-ORBITRAP和QIT質(zhì)譜中都能得到映證。低能CID得到的糖肽譜圖常會(huì)出現(xiàn)一組與糖鏈相關(guān)的中性丟失峰，而糖肽鑒定的關(guān)鍵在與對(duì)這組中性丟失峰的捕獲與解析。我們可以利用圖論方法捕獲糖鏈的中性丟失峰，并可基于此設(shè)計(jì)出針對(duì)復(fù)雜樣本來(lái)源N-糖肽的鑒定方法。我們將此方法先后在標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白和實(shí)際復(fù)雜樣本中進(jìn)行大規(guī)模測(cè)試，得到極高準(zhǔn)確度的驗(yàn)證。應(yīng)用于人類血清樣本的大規(guī)模鑒定，最終得到7

5、45個(gè)N-糖基化肽段。
　　我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中已經(jīng)建立了肝癌轉(zhuǎn)移的小鼠模型，同時(shí)通過(guò)基因芯片和生物質(zhì)譜獲得了轉(zhuǎn)移模型在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平的表達(dá)情況。傳統(tǒng)的分子標(biāo)志物篩選方法，通常先分別探究轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組的差異基因，然后尋找共同的差異基因。這種策略往往會(huì)丟失差異基因在全局水平上的位置，不能充分利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組聯(lián)合篩選的優(yōu)勢(shì)。本研究提出了更為科學(xué)的方法:將轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)投影到二維平面上，用置信橢圓或置信區(qū)間方法篩選差異方向

6、一致的基因。
　　第2章系統(tǒng)鑒定了人肝蛋白質(zhì)組中的糖基化位點(diǎn)。我們首次利用肼腙化學(xué)反應(yīng)法和親水相互作用法兩種非凝集素的廣譜性富集技術(shù)，結(jié)合高精度質(zhì)譜LTQ-ORBITRAP獲取CID和ETD兩種模式下的譜圖，通過(guò)MaxQuant檢索，控制肽段和位點(diǎn)的FDR在1％水平，共得到1，700個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。通過(guò)比較，我們的數(shù)據(jù)集對(duì)國(guó)際上已鑒定的糖基化位點(diǎn)數(shù)據(jù)集形成了大規(guī)模的補(bǔ)充。其中，修飾位點(diǎn)序列模式總體符合N-X-[S|T]模式，同時(shí)

7、還發(fā)現(xiàn)存在一批新的序列模式;在二級(jí)結(jié)構(gòu)域方面，發(fā)現(xiàn)β-折疊上的N-糖位點(diǎn)頻率明顯高于α-螺旋。
　　第3章是關(guān)于糖肽譜圖解析軟件GRIP的核心算法、設(shè)計(jì)、編寫(xiě)和測(cè)試。在對(duì)QIT和LTQ-ORBITRAP兩種質(zhì)譜來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白ASF和HRP測(cè)試中發(fā)現(xiàn):所有的糖基化肽段都能被GRIP正確識(shí)別，充分驗(yàn)證了GRIP對(duì)簡(jiǎn)單樣本來(lái)源的糖肽的識(shí)別能力。標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)也證實(shí)了GRIP優(yōu)于現(xiàn)有的所有糖肽譜圖解析軟件。
　　第4章是GRIP方法

8、在實(shí)際復(fù)雜樣本中的應(yīng)用。我們?cè)O(shè)計(jì)的特色的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，首先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際樣本的去糖基化肽段庫(kù)，再結(jié)合文獻(xiàn)和Glycoworkbench軟件構(gòu)建出人類血清的N-糖組成庫(kù)（365種），組合成理論N-糖肽數(shù)據(jù)庫(kù)。GRIP通過(guò)實(shí)際樣本的CID譜圖與理論N-糖肽數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽的鑒定。同時(shí)我們利用真實(shí)譜圖產(chǎn)生的隨機(jī)譜圖作為GRIP卡閾值的標(biāo)準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白ASF的測(cè)試中證實(shí)了此方案的可行性，在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，用同一母離子下的HCD糖肽譜

9、圖來(lái)驗(yàn)證GRIP的解析結(jié)果，顯示了此方案的高準(zhǔn)確度。所有結(jié)果說(shuō)明GRIP完全有能力對(duì)實(shí)際復(fù)雜樣本的糖肽進(jìn)行鑒定。在人類血清樣本大規(guī)模的測(cè)試中，GRIP最終鑒定到745個(gè)糖肽分子。其中最高豐度的糖蛋白是免疫球蛋白，而大部分糖肽分子都帶有唾液酸或巖藻糖，均與以往研究相符。
　　第5章拓展了GRIP方法，運(yùn)用糖肽碎片庫(kù)技術(shù)來(lái)對(duì)實(shí)際樣本中的糖肽拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。GRIP方法只能獲取糖鏈的組成，因此我們開(kāi)發(fā)了N-糖鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的鑒定體系作為補(bǔ)

10、充。糖肽碎片庫(kù)構(gòu)建的首要問(wèn)題是如何構(gòu)建糖鏈碎片庫(kù)。Glycoworkbench軟件無(wú)法模擬出所有的N-糖碎片，我們采用自建的N-糖碎片構(gòu)建方法。在血清中已知N-糖的最大通用結(jié)構(gòu)，通過(guò)矩陣方法產(chǎn)生所有10，004個(gè)N-糖鏈的子結(jié)構(gòu)。每個(gè)糖鏈結(jié)構(gòu)通過(guò)循環(huán)調(diào)用矩陣方法完成碎片庫(kù)的構(gòu)建。最后我們?cè)O(shè)計(jì)了5種譜圖匹配的打分公式，在模擬和實(shí)際譜圖的測(cè)試結(jié)果表明運(yùn)用糖肽碎片庫(kù)不僅可以得到糖肽的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而且對(duì)同分異構(gòu)體具有一定的識(shí)別能力。
　　第

11、6章是肝癌轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物的篩選。本章提出聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，將轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)投影到二維平面上，用置信橢圓或置信區(qū)間方法篩選差異方向一致的基因。在轉(zhuǎn)移模型測(cè)試中發(fā)現(xiàn)置信區(qū)間方法比置信橢圓方法更為嚴(yán)謹(jǐn)。
　　通過(guò)本文的研究，我們建立了實(shí)際樣本中N-糖肽高通量鑒定的解決方案，為將來(lái)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究中糖肽分子標(biāo)志物的篩選奠定了基礎(chǔ)。此外，本文第5章內(nèi)容為下一步N-糖肽拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定方法研究拉開(kāi)了序幕。在本文第6章肝癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物