蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和進(jìn)展

1、第九章 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和進(jìn)展,,,背 景,基因數(shù)量有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性 vs 生命現(xiàn)象的復(fù)雜性和多變性,從genomic到proteome,對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面深入的研究已成為生命科學(xué)研究的迫切需要和重要任務(wù)。,第一節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及其發(fā)展史 第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述 第三節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用,主要內(nèi)容,第一節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及其發(fā)

2、展史,蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合,意指proteins expressed by a genome，即“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。,一、蛋白質(zhì)組學(xué)的概念,對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。 同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同 。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整

3、體。,蛋白質(zhì)組是：,蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics),指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。,主要研究內(nèi)容,了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類；,明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；,描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的

4、部位。,研究對(duì)象基礎(chǔ)技術(shù)研究層次,功能蛋白質(zhì)組學(xué)(functional proteomics)的提出,功能蛋白質(zhì)組：細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。介于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)之間。,從局部入手研究蛋白質(zhì)組的各個(gè)功能亞群體。 將多個(gè)亞群體組合起來，逐步描繪出接近于生命細(xì)胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。,二、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展,背 景,基因組時(shí)代 →后基因組時(shí)代

5、 研究重點(diǎn)的轉(zhuǎn)移及其標(biāo)志 功能基因組學(xué)的主要任務(wù),,mRNA水平的基因表達(dá)研究取得進(jìn) 展，但mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.4～0.5 蛋白質(zhì)自身特點(diǎn)難以從DNA和mRNA水平得到解答,進(jìn) 展,各國政府支持，國際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF）,,美國國立癌癥研究院（NCI）

6、投資1 000萬美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。NCI和FDA共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。英國建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將完成全基因組測序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。,,,,Celera公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫的工作。,,1997年召開了第一次國際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議 1998年在美國舊金山

7、召開了第二屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議 1999年1月在英國倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議,,,,我國也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì),,2003成立了中國人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開了中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，2004年10月在中國北京召開了第三屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。,科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研

8、究列入我國“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展。,,第二節(jié) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述,蛋白質(zhì)組研究更為復(fù)雜和困難： 蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目。 蛋白質(zhì)隨時(shí)間和空間而變化。,,,發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。,當(dāng)前主要任務(wù)

9、,一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的 研究方法,研究蛋白質(zhì)組的組成成分 支撐技術(shù)主要有雙向凝膠電泳、以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及生物信息學(xué)分析。,蛋白質(zhì)組表達(dá)模式（expression profile）：,（一）蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備,通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。 也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。,樣品預(yù)分級(jí)的主要方法,蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等

10、蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等,,樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。,組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備,臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤中癌變的上皮類細(xì)胞總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。,激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM),可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞群。,（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣

11、品分離,雙向凝膠電泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量，結(jié)合凝膠化學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。,原 理,第一向在高壓電場下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由O’Farrell等創(chuàng)立。,,,特 點(diǎn),可分離10～100 kD分子量的蛋白質(zhì) 高靈敏度和高分

12、辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理 與質(zhì)譜分析匹配,第一向IEF電泳,,傳統(tǒng)O’Farrell系統(tǒng)雙向電泳的缺陷。Bjellgvist等發(fā)展并完善了固相pH梯度等電聚焦技術(shù)，GÖrg等成功地將之應(yīng)用于雙向電泳。 優(yōu)點(diǎn),固相pH梯度等電聚焦的優(yōu)點(diǎn),克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等缺點(diǎn)。穩(wěn)定的可以隨意精確設(shè)定的pH梯度。 尤其可在較窄的pH范圍內(nèi)進(jìn)行第二輪分析，大大提高了分辨率及重復(fù)性。,,,第二向SDS-P

13、AGE電泳,垂直板電泳 水平超薄膠電泳,,,2-DE技術(shù)的缺點(diǎn),極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。 膠內(nèi)酶解過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。,,,新型非凝膠技術(shù),液相色譜法liquid chromatography，LC毛細(xì)管電泳capillary electrophoresis，CE,,,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）,蛋

14、白質(zhì)混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。,根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復(fù)合物。,多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS）,多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensional protein identification technology),（三）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定,傳統(tǒng)方法：蛋白質(zhì)微量測序

15、 氨基酸組成分析,新型蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) —— 質(zhì)譜（MS）法,基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。,“軟電離”的特點(diǎn),分子電離時(shí)保留整個(gè)分子的完整性，不會(huì)形成碎片離子。 靈敏度高、快速、能同時(shí)提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來分析復(fù)雜體系。,基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted l

16、aser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）,主要質(zhì)譜類型,鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線,通過肽質(zhì)譜指紋圖（peptide mass fingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配 通過測出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息

17、或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配,,,,,目 錄,儀 器,MALDI-TOF質(zhì)譜儀：靈敏度高（可達(dá)fmol），分析速度快，譜圖簡單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小,肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫中匹配不成功的可能原因,樣品量太少，PMF圖信噪比太低，輸入庫中搜尋的數(shù)據(jù)質(zhì)量不好。2-DE膠上所取的一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)并非單一蛋白質(zhì)，所獲PMF圖實(shí)際上是兩個(gè)以上蛋白質(zhì)的混合圖。,操作中角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫中未有

18、記載所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫規(guī)模太小,續(xù)：,組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù) 兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS） 表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）,聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì),,,,,（四）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué),生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)不可缺少的部分。,構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜 數(shù)

19、據(jù)庫的搜索與構(gòu)建,應(yīng) 用,,,,蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ),瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB 和dbEST數(shù)據(jù)庫。,dbEST數(shù)據(jù)庫,,由美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所（EBI）共同編輯，包括許多生物體的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）,,,肽序列標(biāo)簽(PST)或部分序列信息最適合查尋,概念：把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一

20、個(gè)復(fù)雜體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定。,（五）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究,低豐度蛋白質(zhì)檢測困難 蛋白質(zhì)表達(dá)量差異很小，如在50%以下時(shí)，精確定量成為瓶頸 蛋白質(zhì)表達(dá)的瞬時(shí)變化,蛋白質(zhì)定量的難點(diǎn),,,,1．基于雙向凝膠電泳的定量 蛋白質(zhì)組研究策略,雙向凝膠電泳(2-DE)是目前唯一能分離展示大量蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析的一種方法。 熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE）,,,2．基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究

21、策略,原理：對(duì)于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽，可以通過比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)量。,二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法,揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。,主要研究目標(biāo),（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究,,翻譯后修飾,,,,,,,,糖基化,乙?；?甲基化,羧基化,二硫鍵,修飾肽的檢測的高靈敏度方法 蛋白質(zhì)翻譯后修飾的定量分析

22、 合適的修飾狀態(tài)下處理和電離條件 測定工作量巨大,研究面臨的困難：,（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),生命的基本過程是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用 新陳代謝以蛋白質(zhì)復(fù)合體或多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn) 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病原體感染和免疫反應(yīng),1989年Field 和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計(jì)的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法。以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)為基礎(chǔ)的。,1．酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid sys

23、tem）,轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的特點(diǎn),N端含NLS和與酵母GAL1基因啟動(dòng)子上游激活序列(UASG)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域C端含GAL1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,功能上相互獨(dú)立又互相依賴，只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄因子活性,系 統(tǒng) 構(gòu) 建,分別構(gòu)建含GAL4 BD 和AD 的兩個(gè)酵母融合蛋白表達(dá)載體；建立含特殊基因型、適用于雙雜交體分析的酵母菌株,主要特點(diǎn)和優(yōu)勢,使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系篩選cDNA文庫真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作

24、用情況不需分離靶蛋白敏感性高,,缺 點(diǎn),1.假陽性結(jié)果 2.假陽性結(jié)果 3.限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用,2．噬菌體表面顯示技術(shù) ( phage display ),三個(gè)基本因素： 在噬菌體pⅢ和pⅧ衣殼蛋白N端插入外源待篩基因編碼的蛋白，形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面；同時(shí)其保持的外源蛋白天然構(gòu)象能被相應(yīng)的抗體或受體識(shí)別,,利用固相支持物上的抗體或受體，采用親和篩選法（panning），從噬菌體文

25、庫中篩選出能結(jié)合篩選分子的目的噬菌體。外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來。,主 要 應(yīng) 用,篩選與特異抗體或受體相互作用的蛋白質(zhì) 研究抗體或受體的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建隨機(jī)肽庫、抗體庫和蛋白文庫 改造和提高蛋白質(zhì)的生物學(xué)和免疫學(xué)特性 研究新型多肽藥物、疫苗和抗體 研究涉及到蛋白質(zhì)與核酸相互作用的生物學(xué)過程和新型的基因治療導(dǎo)向系統(tǒng),主要優(yōu)點(diǎn),在細(xì)菌外完成 高度的選擇性 親和純化反

26、應(yīng)高效性 不需要了解篩選分子結(jié)構(gòu),缺 點(diǎn),限制肽段大小外源蛋白質(zhì)無法正確折疊或修飾 融合蛋白可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)本身活性,3．基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法,靶蛋白制備 蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化 蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定,基本步驟：,（1）親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),基本原理：將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的

27、蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。,先決條件,得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌（bait） 獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質(zhì),利用含靶蛋白的融合蛋白獲得相互作用蛋白質(zhì),谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白,主要優(yōu)點(diǎn),靈敏度高：高濃度靶蛋白 候選蛋白質(zhì)與靶蛋白的結(jié)合機(jī)會(huì)均等 檢測多亞基蛋

28、白質(zhì)之間的相互作用,（2）免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),原理：以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。,研究鼻咽癌細(xì)胞系中的p53相互作用蛋白,抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀SDS-PAGE分離免疫沉淀復(fù)合物切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/

29、MS）分析，得到相應(yīng)的肽序列標(biāo)簽 搜索數(shù)據(jù)庫,特 點(diǎn),生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)之間的相互作用所有蛋白質(zhì)與靶蛋白的相互作用可檢測依賴于修飾的蛋白質(zhì)相互作用,,,,局 限 性,A. 靈敏性不高 B. 假陽性C. 受免疫球蛋白的干擾較大,Biacore基于表面等離子共振（SPR）進(jìn)行生物大分子相互作用分析(BIA) 質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS）鑒定Biacore芯片上配體所捕獲的生物分子,（3）生物傳感器耦

30、聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),組 成,當(dāng)生物大分子結(jié)合（如蛋白質(zhì)相互作用）時(shí)會(huì)引起作用表面(芯片)折射率的變化，這種光信號(hào)可被光感受器接受并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到計(jì)算機(jī)，再由計(jì)算機(jī)還原為模擬的生物信號(hào)。,Biacore的基本工作原理,（4）串聯(lián)親和純化耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),基本原理：在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白質(zhì)標(biāo)記（TAP Tag），經(jīng)過特異性的兩步親和純化，在生理?xiàng)l件下與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)便可洗脫下來，然后用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)得到的蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行鑒定。,主要流程,雙

31、重分子標(biāo)簽構(gòu)建到靶蛋白 ↓ 表達(dá)融合蛋白 ↓ 制備細(xì)胞裂解液 ↓ IgG柱純化 ↓ TEV蛋白酶的洗脫液洗脫蛋白質(zhì)復(fù)合體,↓

32、 耦聯(lián)鈣調(diào)素的親和柱純化 ↓ 洗脫 ↓ 含EGTA的洗脫液洗脫 ↓ 質(zhì)譜鑒定結(jié)合蛋白質(zhì),續(xù)：,特 點(diǎn),獲得生理?xiàng)l件下與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì) 鑒定出在空間上非直接物理相互作用的蛋白質(zhì)適用于大規(guī)模蛋白質(zhì)相互作用研究,基本原理：將高度密集