Ang2-siRNA質粒殼聚糖磁性納米微粒靜脈給藥安全性毒理實驗及體內靶向性實驗.pdf

1、目的：
　　擬用本實驗前期制備的Ang2-siRNA質粒殼聚糖磁性納米微粒，經尾靜脈注射入小鼠及大鼠體內，觀察該微粒的安全性及毒理性，建立惡性黑色素瘤裸鼠模型，觀察Ang2-siRNA質粒殼聚糖磁性納米微粒的靶向性，為后期進一步進行裸鼠惡性黑色素移植瘤的血管生成和腫瘤生長的體內靶向性干預實驗奠定基礎，為惡性黑色素瘤的基因靶向治療提供新途徑和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒急

2、性毒性實驗
　　急性毒性實驗的考察選擇KM小鼠作為實驗對象，分別經尾靜脈一次性給予小鼠五種濃度（91.6mg/kg、152.8mg/kg、254.6mg/kg、424.2mg/kg、707.0mg/kg）的Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒，對照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)觀察14天內小鼠的死亡、飲食及體重變化，大體標本觀察臟器顏色、形態(tài)，并且對心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進行病理組織檢查，HE染色和普魯士染色觀察臟器的

3、情況。
　　2、Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒重復給藥實驗研究
　　慢性毒性實驗將SD大鼠作為實驗對象，將其分為四組，即低、中、高濃度劑量組（35.35mg/kg、70.70mg/kg、353.50mg/kg）及對照組，對照組予以注射生理鹽水，均予以尾靜脈注射微粒懸浮液1ml，連續(xù)注射14d，第15d停藥，繼續(xù)觀察7d，觀察給藥后大鼠的一般表現(xiàn)及體重變化情況，第21d處死小鼠，取眼球血進行血常規(guī)及生化檢查，大

4、體標本觀察臟器顏色、形態(tài)，對主要臟器進行病理學檢查，HE染色和普魯士染色觀察臟器的情況。
　　3、Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒體內靶向性研究
　　構建惡性黑色素瘤裸鼠移植瘤模型，將處于對數(shù)生長期的惡性黑色素瘤細胞制成細胞懸液，將其接種于裸鼠右腋皮下，待裸鼠皮下腫瘤長至約6mm×6mm時，將荷瘤鼠隨機分成3組，分別為靶向組，非靶向組以及空白對照組。靶向組荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射殼聚糖磁性納米微粒溶液0.4ml，

5、緊貼右腋皮下外加4000GS的磁場，60min后撤去磁場，同時立即處死裸鼠；非靶向組荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射質粒耦連微粒0.4ml，體外不加磁場，60min后立即處死裸鼠；空白對照組的荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射等體積的生理鹽水，體外不加磁場，60min后立即處死裸鼠。處死后進行腫瘤組織病理學檢查，HE染色及普魯士藍染色驗證微粒在腫瘤組織中的分布。
　　結果：
　　1、Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒急性毒性實驗

6、>　　空白組及各濃度組小鼠給藥后均未出現(xiàn)死亡，Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒的LD50>707.0mg/kg，遠高于臨床所需量，對小鼠的飲食、體重無明顯影響，且主要臟器除了高濃度組引起部分肺淤血外，余未見明顯異常，表明其急性毒性相對較低。
　　2、Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒重復給藥實驗研究
　　Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒對大鼠的一般活動表現(xiàn)、飲水、攝食、體重增長以及肝腎

7、功能無明顯影響，經大鼠主要臟器病理學組織檢查，中、高劑量組引起大鼠肺部慢性非肺淤血及纖維化，低劑量組大鼠主要臟器組織病理學未見明顯異常，可以認為本實驗的最低劑量35.35mg/(kg.d)×14d，對受試動物基本無毒性，所以在一定的濃度范圍內，該藥物長期使用是安全的。
　　3、Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒體內靶向性研究
　　空白對照組腫瘤組織普魯士藍染色陰性，非靶向組腫瘤組織普魯士藍染色呈弱陽性，靶向組腫瘤

8、組織被膜及血管內大量的顆粒聚集，普魯士藍染色強陽性。由此可以推斷，Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒在外加磁場的作用下，能定向向腫瘤組織移動，并且聚集在惡性黑色素移植瘤內，從而達到抑制腫瘤生長的目的。
　　結論：
　　Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒毒作用的靶器官主要是肺部，主要是引起肺部炎癥，急慢性肺淤血，肺部纖維化，但是該微粒對小鼠、大鼠的一般表現(xiàn)、攝食、飲水、體重及肝腎功能無明顯影響。其LD5

9、0>707.0mg/kg，長期毒性無毒反應劑量>35.35mg/(kg.d)×14d，根據(jù)等效劑量系數(shù)折算法，人的無毒反應劑量劑量>222.71mg/(kg.d)×14d，即3117.87mg/kg，遠高于臨床所需量，可以認為在一定劑量范圍內，該顆粒是安全的。Ang2-siRNA質粒載體殼聚糖磁性納米微粒體內靶向性研究證明了在外加磁場的作用下，該微粒能夠定向向靶組織移動，具有靶向給藥系統(tǒng)載體的特性，可以作為一種可靠有效的靶向給藥載體，在