用于胰島素口服給藥和腫瘤靶向的殼聚糖衍生物接枝納米粒.pdf

1、為研究生物大分子藥物口服給藥系統(tǒng),分別制備了殼聚糖鹽酸鹽接枝納米粒(CHNPs)、殼聚糖季銨鹽接枝納米粒(TMCNPs)、羧化殼聚糖接枝納米粒(CCNPs)和羧甲基殼聚糖接枝納米粒(CMCNPs),考察其理化性質(zhì)。以胰島素為模型藥物,研究納米粒的載藥特性、體外釋藥規(guī)律、體內(nèi)作用及吸收機(jī)理。以香豆素(6-cournarin)標(biāo)記的CCNPs為載體,研究其在腫瘤靶向中的應(yīng)用。
　　 1殼聚糖衍生物接枝納米粒的制備和表征
　　

2、 分別以殼聚糖鹽酸鹽(CH)、殼聚糖季銨鹽(TMC)、羧化殼聚糖(CC)和羧甲基殼聚糖(CMC)為親水大分子單體,甲基丙烯酸甲酯(MMA)為疏水單體,經(jīng)接枝共聚形成兩親性大分子,水溶液中自組裝形成核殼型的CHNPs、TMCNPs、CCNPs和CMCNPs?？疾旒{米粒的結(jié)構(gòu)、粒徑、Zeta電勢(shì)、形態(tài)和穩(wěn)定性等。結(jié)果表明,制得的納米粒粒徑為100～300nm,粒徑分布均勻:CHNPs和TMCNPs的Zeta電勢(shì)為正值,CCNPs和CMCNP

3、s的Zeta電勢(shì)為負(fù)值;CCNPs在胃液中聚集,腸液中分散成納米粒;CCNPs和CMCNPs凍干和室溫貯存穩(wěn)定性良好。
　　 2載胰島素納米粒研究
　　 考察載胰島素納米粒的形態(tài)、粒徑、Zeta電勢(shì)、包封率、載藥量及體外釋放性質(zhì)。采用內(nèi)源熒光光譜、外源熒光光譜、圓二色譜和雙熒光標(biāo)記法研究胰島素在納米粒中的載藥方式。結(jié)果表明,TMCNPs和CCNPs的包封率大于80％,載藥量高于10％;CHNPs和CMCNPs的包封率和載

4、藥量較低;載胰島素前后CCNPs的粒徑和形態(tài)未發(fā)生明顯變化:Zeta電勢(shì)隨胰島素濃度增加其絕對(duì)值減小;胰島素可通過(guò)氫鍵、靜電作用及范德華力包載至納米粒;載胰島素納米粒的體外釋放具pH敏感性。
　　 研究胰島素-CCNPs在正常大鼠、糖尿病大鼠及Beagle犬體內(nèi)的口服降血糖效果。與胰島素溶液相比,正常大鼠皮下注射胰島素-CCNPs后血糖最低下降至初始值的41％。正常大鼠口服胰島素溶液及不同劑量胰島素-CCNPs,100u·kg-

5、1時(shí),2～12h內(nèi)血糖降為初始值的80％～67％;15u·kg-1時(shí),降血糖效果不明顯;對(duì)照組胰島素溶液無(wú)降血糖效果;胰島素-CCNPs(25u·kg-1)的口服藥理生物利用度為9.7％。糖尿病大鼠口服胰島素-CCNPs,6～16h內(nèi)血糖濃度降低為初始值的80％以下,16h達(dá)到最低值,為初始值的35％。Beagle犬口服胰島素-CCNPs(16.5u·kg-1),4h內(nèi)血糖降低為初始值的60～80％。
　　 考察CCNPs體外抑

6、酶作用和對(duì)腸道緊密連接的影響,并研究香豆素標(biāo)記的CCNPs在Peyer's結(jié)處的吸收。結(jié)果表明,CCNPs可使胰蛋白酶活力下降75％,胃蛋白酶活力下降80％;CCNPs可打開(kāi)腸道緊密連接,并在腸道Peyer's結(jié)處被吸收。
　　 選擇FITC-胰島素和藻藍(lán)蛋白包載至納米粒,進(jìn)一步研究胰島素口服吸收機(jī)理。測(cè)定FITC-胰島素與胰蛋白酶作用后的熒光光譜;考察SD大鼠口服FITC-胰島素和載FITC-胰島素的CCNPs后的體內(nèi)分布;分

7、別測(cè)定藻藍(lán)蛋白與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用后的紫外光譜和熒光光譜。結(jié)果表明,FITC-胰島素與胰蛋白酶作用后,熒光強(qiáng)度增強(qiáng);大鼠口服FITC-胰島素和載FITC-胰島素的CCNPs6h后,肝、脾中熒光均較強(qiáng);藻藍(lán)蛋白與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用后,紫外吸收和熒光強(qiáng)度均減小,蛋白濃度與紫外吸收及熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)。
　　 3載黏膜黏附性納米粒雙層膜口服給藥載體
　　 以Na2-EDTA為交聯(lián)劑制備殼聚糖水凝膠,加入CCNPs

8、凍干粉,以乙基纖維素膜為背襯層制備載納米粒殼聚糖水凝膠雙層膜(NP-FilmCH)。對(duì)殼聚糖水凝膠膜的形態(tài)、粘度、流變行為和體外黏附力等進(jìn)行表征,并考察CCNPs在不同介質(zhì)中的體外釋放特性。殼聚糖水凝膠具有典型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),納米粒可分散其中。殼聚糖水凝膠膜的黏膜黏附力為殼聚糖鹽酸鹽膜的2～8倍,在回腸處的黏膜黏附力較大。pH1.2釋放介質(zhì)中,納米粒從水凝膠膜中釋放較慢;pH7.4PBS釋放介質(zhì)中,納米粒釋放較快。
　　 將CCNP

9、s凍干粉載入海藻酸鈉水凝膠中并以疏水性乙基纖維素膜為背襯層制備雙層膜(NP-FilmSA)。熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察納米粒在雙層膜中形態(tài),考察水凝膠的溶脹性、黏膜黏附性和納米粒釋放特性,以鈣黃綠素作為熒光模型多肽,觀察載藥納米粒在水凝膠膜中的形態(tài)。離子強(qiáng)度較低時(shí),海藻酸鈉水凝膠膜溶脹率較高;離子強(qiáng)度較高時(shí),其溶脹率較低;pH5.8和pH8.0時(shí),其溶脹率較高,pH1.7時(shí),其溶脹率較低。海藻酸鈉水凝膠膜的體外黏膜黏附力達(dá)6000N·m-

10、2。0.01mol·1-1HCl中,CCNPs釋放較慢,2h累計(jì)釋放量約為10％;pH6.5和pH7.4PBS中,CCNPs快速釋放。海藻酸鈉水凝膠膜含較多孔隙,大小均一的納米?？删鶆蚍稚⒃诳紫吨?。
　　 4香豆素標(biāo)記CCNPs在腫瘤細(xì)胞中的分布
　　 以親脂性熒光染料香豆素標(biāo)記CCNPs,比較香豆素標(biāo)記CCNPs在H1299肺癌和HEK293胚腎細(xì)胞中的分布情況,研究其組織分布、活體光學(xué)成像及體外巨噬細(xì)胞攝取。結(jié)果表明

11、,香豆素標(biāo)記CCNPs可被H1299細(xì)胞攝取,而不被HEK293胚腎細(xì)胞攝取。納米粒定向聚集于腫瘤部位,肺、肝、腎和脾臟的攝取較少,具有一定的靶向性。
　　 5生物相容性研究
　　 以溶血試驗(yàn)、動(dòng)態(tài)凝血時(shí)間測(cè)定、血小板黏附和形態(tài)學(xué)觀察等方法研究納米粒的血液相容性,小腸生化損傷、肌肉植入和組織損傷等試驗(yàn)研究材料的組織相容性。CCNPs、CMCNPs和TMCNPs溶血率均低于5％,符合生物材料溶血率要求。與硅化玻璃相比,CC