原花青素對LPS誘導的THP-1細胞的影響作用研究.pdf

1、背景及目的:
　　膿毒癥(sepsis)是嚴重感染、休克、燒傷等重癥感染患者常見的并發(fā)癥，可進一步發(fā)展成為多器官功能衰竭（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS），其發(fā)病迅速，病死率高。目前對于膿毒癥的發(fā)病機制已逐漸有一致的看法，即全身炎癥反應綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)是形成膿毒癥及多器官功能衰竭重要的病理學基礎和形成的根本原因。

2、
　　MAPK信號轉導通路存在于大多數(shù)細胞內，其中的p38(38kDaprotein)絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)為細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶激酶，是介導細胞反應的重要信號系統(tǒng)，在炎癥反應中起著十分重要的作用。在SIRS中產(chǎn)生的炎癥因子眾多，其中TNF-α是最重要的炎癥介質。相關報告中指出原花青素在內毒素刺激的單核-巨噬細胞中作為抗炎劑，其抗炎機制可能是通過對核轉

3、錄因子轉化的抑制作用來調節(jié)激活的單核巨噬細胞的免疫應答，從而發(fā)揮抗炎的效應。
　　本文通過LPS誘導THP-1細胞構造膿毒癥體外模型，揭示原花青素對膿毒癥細胞模型具有顯著的保護作用，且在較大的藥物濃度范圍內無毒副作用。證實原花青素能夠抑制TNF-α等炎性因子的釋放，探討原花青素抑制TNF-α的釋放與p38MAPK通路的關系。
　　方法:
　　將人THP-1細胞進行體外培養(yǎng)（37℃、5％CO2的孵箱內），至對數(shù)生長期后，

4、加入LPS1ug/ml制造膿毒癥模型。首先利用細胞藥物毒性實驗(CCK-8)，一是研究原花青素對THP-1細胞增殖活性是否有影響。二是選取藥物作用的三個時間點，即6h，12h，24h，在各時間點下依據(jù)不同的藥物濃度進行分組，研究原花青素對LPS誘導的THP-1細胞生存率的影響，從而選擇藥物作用較適宜的時間及藥物濃度;其次利用ELISA檢測不同藥物濃度下TNF-α的相對蛋白濃度，選擇原花青素最佳的藥物作用濃度。最后，利用Westernbl

5、otting測p38及NF-κB蛋白的表達量，揭示原花青素抑制TNF-α的釋放與p38MAPK通路的關系。
　　結果:
　　1、利用CKK-8試劑盒對細胞增殖的活性進行測定，酶聯(lián)免疫檢測儀測450nm處測定吸光度值，用各組細胞活力值(％)表示。與對照組相比，不同的原花青素濃度下變化不明顯，對THP-1細胞增殖活力的影響沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、(1)利用CCK-8試劑盒對各組細胞生存率進行測定，用細胞活

6、力值(％)表示。于6h，12h，24h這三個不同的藥物作用時間點下，LPS+不同濃度藥物組的細胞活力均低于對照組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)不同的藥物作用時間點下，隨著原花青素濃度的不斷增加，各組細胞生存率均呈現(xiàn)出先降低后逐漸上升的趨勢，當原花青素的藥物濃度于100ug/ml時細胞生存率再次下降。故為節(jié)約資源及簡化操作，本實驗將采12h組50ug/ml和100ug/ml兩個藥物濃度進行下一步研究。
　　3、(

7、1)ELISA法檢測不同藥物濃度組細胞上清液中TNF-α的相對蛋白濃度，與對照組相比，實驗組THP-1細胞TNF-α的相對蛋白濃度差異明顯(P＜0.05);
　　(2)單純LPS組釋放TNF-α的相對蛋白濃度最高，50ug/ml和100ug/ml兩原花青素處理組TNF-α的相對蛋白濃度低于單純LPS誘導組(P＜0.05)，說明兩種濃度作用下的原花青素均能很好的降低經(jīng)LPS誘導的THP-1細胞釋放TNF-α的量;
　　(3)5

8、0ug/ml和100ug/ml兩濃度原花青素處理組進行組間比較，100ug/ml濃度組對TNF-α的抑制效果更為明顯(P＜0.05)，故選定該濃度用于蛋白水平的研究。
　　4、(1)利用Westernblotting檢測原花青素對LPS刺激的p38蛋白的表達，不同處理組與空白對照組P-p38相對表達量存在顯著差異(P＜0.05)。LPS組P-p38相對表達量最高，原花青素處理組的表達量最低。
　　(2)利用Westernbl

9、otting檢測NF-κB蛋白的表達，對不同組的蛋白相對表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同處理組與空白對照組的結果存在顯著差異(P＜0.05)。LPS組THP-1細胞的NF-κB相對表達量最高，原花青素處理組的NF-KB相對表達量最低。該蛋白表達量在不同處理組的差異趨勢與P-p38的Westernblotting檢測結果基本一致。
　　結論:
　　1、膿毒癥是感染因素造成的全身炎癥反應，細菌感染是膿毒癥發(fā)病的主要原因，其中革蘭氏陰性菌