EGb761對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放HMGB1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景:在ICU患者中膿毒癥為主要死亡原因之一，總體死亡率大約為30％-40％，而在老年患者或者伴隨有其他基礎(chǔ)疾病的患者中死亡率超過70％。根據(jù)新的流行病學(xué)調(diào)查，在美國(guó)統(tǒng)計(jì)重癥膿毒癥的發(fā)病率大約為千分之三，大約一半發(fā)生在ICU病房以外，40％的膿毒癥病人死于醫(yī)院，膿毒癥休克死亡率最高，可達(dá)到50％。國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者在膿毒癥發(fā)病機(jī)制方面也開展了大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究，但是至今仍沒有達(dá)到一個(gè)共識(shí)結(jié)論。傳統(tǒng)認(rèn)為過度的炎癥細(xì)胞和介質(zhì)激活是

2、膿毒癥導(dǎo)致臟器損傷的主要原因，但是近期國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者卻發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白是膿毒癥的晚期介質(zhì)，其中在大部分膿毒癥患者中會(huì)升高。HMGB1由激活的免疫細(xì)胞合成，可與TLR-2、TLR-4發(fā)生關(guān)聯(lián)，從而啟動(dòng)與LPS類似的炎癥反應(yīng)。HMGB1還會(huì)引起凝血因子和中性粒細(xì)胞的聚集，與促炎細(xì)胞因子IL-1等相比，LPS刺激HMGB1的釋放發(fā)生于相對(duì)較晚的階段。盡管HMGB1在嚴(yán)重膿毒癥患者中升高，但是其對(duì)膿毒癥的預(yù)后并沒有預(yù)測(cè)意義。向?qū)嶒?yàn)小鼠注射HM

3、GB1是致命的，而用HMGB1抗體對(duì)內(nèi)毒素和盲腸結(jié)扎穿孔小鼠具有一定治療作用，因此推斷HMBG1可能是膿毒癥治療的新靶點(diǎn)。
　　中藥銀杏葉提取物(extract of Ginkgobiloba，EGb761)是從銀杏葉中提取的天然活性物質(zhì)，其中主要有效成分為黃酮糖苷類(24％)和菇烯內(nèi)醋類(6％)，EGb761也是一類純天然抗氧化劑，調(diào)節(jié)多種抗氧化酶活性，具有抗炎、抗癌、抗衰老、抑制血小板聚集等多種藥理活性。也有研究表明EGb76

4、1對(duì)早期炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的有一定的抑制作用，國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道EGb761能夠減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，但目前國(guó)內(nèi)外尚未有EGb761對(duì)HMGB1蛋白影響的研究。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，觀察銀杏葉提取物EGb761對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放HMGB1蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及以后臨床運(yùn)用提供可行的依據(jù)。
　　材料與方法:1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組
　　1.1 THP-1細(xì)胞的

5、培養(yǎng)
　　將分離的細(xì)胞收入離心管中，1000r/min，離心10min棄上清，用含20％ FBS的RPMI1640培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至(110-115)×106/cm2，種入培養(yǎng)皿，在37℃，5％條件下CO2培養(yǎng);次日換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2-3日換液1次。
　　1.2 將生長(zhǎng)良好的THP-1隨機(jī)分為5組(n=3)。
　　(1)炎性因子檢測(cè)組:THP-1+EGb761(50μg/m1)+LPS(1μg/

6、ml)
　　(2)NF-κB的活化檢測(cè)組;THP-1+EGb761(50μg/ml)+LPS(1μg/ml)
　　(3)不同時(shí)間點(diǎn)HMGB1蛋白檢測(cè)組:THP-1+LPS(1μg/ml)
　　(4)不同濃度EGb761對(duì)HMGB1影響檢測(cè)組:THP-1+EGb761(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)+LPS(1μg/ml)
　　(5)HMGB1核轉(zhuǎn)位組:THP-1+EGb761(50μg/ml

7、)+LPS(1μg/ml)
　　2.觀察指標(biāo)
　　2.1 ELISA檢測(cè)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)
　　將稀釋均勻的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，每孑加入細(xì)胞懸浮液1ml及濃度50μg/ml EGb761預(yù)處理2h后，用濃度為1μg/ml LPS誘導(dǎo)（均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔）6h和12h，吸取培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書操作。用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。<

8、br>　　2.2 Western blotting檢測(cè)NF-κB的活化
　　將稀釋均勻的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細(xì)胞懸浮液1ml及濃度50μg/ml EGb761預(yù)處理2h后用濃度為1μg/mL LPS誘導(dǎo)（均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔）4h、6h和12h后，裂解離心提取上清液并提取蛋白，在4℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育，采用化學(xué)發(fā)光顯色法，以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值的

9、比值(IOD值)定為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.3 Western blotting檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HMGB1蛋白的表達(dá)
　　將稀釋均勻的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細(xì)胞懸浮液1ml及濃度為1μg/ml LPS誘導(dǎo)（均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔）6h、12h、18h后，收集細(xì)胞上清液裂解離心提取蛋白，在4℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育，采用化學(xué)發(fā)光顯色法，以目的條帶和β-actin條

10、帶積分光密度值的比值（IOD值）定為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.4 Western blotting檢測(cè)不同濃度EGb761對(duì)HMGB1表達(dá)影響
　　將稀釋均勻的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細(xì)胞懸浮液1ml，按濃度50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml的EGb761分為三組預(yù)處理2h，用濃度為1μg/mlLPS誘導(dǎo)（均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔）18h后裂解離心提取蛋白，在4℃一抗孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山

11、羊抗鼠IgG(1∶5000稀釋)孵育，采用化學(xué)發(fā)光顯色法，以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值的比值（IOD值）定為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　2.5 共聚焦熒光顯微鏡觀察HMGB1蛋白的核轉(zhuǎn)位
　　將稀釋均勻的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中每孔加入細(xì)胞懸浮液1ml和濃度150μg/mlEGb761預(yù)處理2h后，用濃度為1μg/ml LPS誘導(dǎo)（均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔）18 h，采用共聚焦顯微鏡熒光法標(biāo)記，HMGB1蛋白用綠色

12、熒光標(biāo)記，細(xì)胞核用藍(lán)色熒光標(biāo)記為對(duì)照，將兩者重疊后在熒光顯微鏡下觀察HMGB1在細(xì)胞內(nèi)分布變化。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行處理。采用單因素方差分析不同組別間的比較，以(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.ELISA檢測(cè)炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞6

13、-12h后，可分泌大量的IL-1β、IL-6、TNF-α炎性因子較空白對(duì)照組高(P＜0.05)。培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯增加，經(jīng)過EGB761干預(yù)后，THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度較LPS組明顯降低有顯著的差異(P＜0.05)。
　　2.EGb761對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB活化檢測(cè)
　　Western blotting檢測(cè)THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，NF-κB表達(dá)增高，經(jīng)過

14、EGB761干預(yù)2-12h，THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液中NF-κB含量隨著EGb761干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)較空白對(duì)照組呈明顯下降趨勢(shì)(P＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞不同時(shí)間段釋放HMGB1蛋白表達(dá)變化
　　Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞12h后，細(xì)胞上清液中HMGB1蛋白含量較空白組升高，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)18h HMGB1蛋白含量呈明顯升高趨勢(shì)(P＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

15、義。
　　4.不同濃度的EGb761對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生HMGB1蛋白表達(dá)的變化
　　Westemblottting檢測(cè)結(jié)果顯示:EGb761干預(yù)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞18h后上清液中HMGB1蛋白含量較空白對(duì)照組低，HMGB1蛋白含量隨著EGB761濃度增加至150μg/ml呈下降趨勢(shì)并呈劑量依賴效應(yīng)(P＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.EGb761抑制LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放HMGB1蛋白核轉(zhuǎn)位<

16、br>　　在共聚焦顯微鏡下顯示:空白組HMGB1幾乎全部分布在核內(nèi);LPS誘導(dǎo)組可見HMGB1大部分從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞漿中;EGb761和LPS干預(yù)組均可見部分HMGB1分布。
　　結(jié)論:1.LPS可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)增多及NF-κB活化，導(dǎo)致HMGB1蛋白表達(dá)增多及核轉(zhuǎn)位。
　　2.EGB761能抑制THP-1細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)及NF-κB活化，調(diào)節(jié)HMGB1蛋白的表