用FRET技術(shù)研究TRPC1和Akt在細胞遷移中的相互作用.pdf

1、背景：
　　 細胞遷移(cell migration)是指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動。細胞遷移需要內(nèi)外因素的配合，外部因素如表皮生長因子、白細胞介素1等信號分子;細胞內(nèi)因素有信號傳導(dǎo)系統(tǒng)、細胞骨架和分子馬達、參與粘著斑形成的各種分子等。具體過程為細胞外信號分子與細胞膜表面上的受體結(jié)合，啟動細胞內(nèi)的信號分子，細胞內(nèi)的信號分子將運動信息進一步傳給細胞遷移的執(zhí)行單位——細胞骨架和分子馬達，進而完成一系

2、列的遷移活動。種類繁多的細胞內(nèi)信號分子會相互作用，從而影響細胞骨架和分子馬達的分布、結(jié)構(gòu)和活性，達到精細調(diào)整細胞運動的目的。
　　 瞬時受體電位通道(TRP channels)是位于細胞膜上的一類重要的非選擇性陽離子通道超家族，主要通透鈣離子、鈉離子等。所有的TRP通道蛋白均具有6次跨膜結(jié)構(gòu)域，形成4聚體(tetramers)，于5～6段間形成離子通道小孔，通過細胞的雙層脂膜供陽離子進出細胞。最初人們對TRP離子通道的認識僅限于

3、感覺系統(tǒng)，因為該通道通過感受細胞內(nèi)外環(huán)境的各種刺激，參與痛溫覺、機械感覺以及味覺的發(fā)生和維持細胞內(nèi)外的離子穩(wěn)態(tài)等眾多生命活動。
　　 TRPC分子的C末端以TRP框為起點，存在一個保守的25個氨基酸序列區(qū)，它與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的通道門控位點有關(guān)，TRP結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)TRP通道的功能。TRPC亞家族包括TRPC1-7，共7種亞型。TRPC1在腦、心臟、腎臟、肺、骨骼肌、前列腺、皮膚、睪丸和卵巢都檢測到其高水平表達。作為最早被發(fā)現(xiàn)的哺

4、乳動物TRP通道，公認的TRPC1的功能是參與受體介導(dǎo)的、鈣依賴的平滑肌及腺體的分泌和收縮功能，參與細胞膜受體激活磷脂酶C(PLC)后所介導(dǎo)的鈣離子進入。TRPC1通道是一種非選擇性陽離子通道，主要通透的離子為鈣離子、鈉離子。TRPC1通過參與多種信號通路調(diào)節(jié)細胞的生長及凋亡、樹突形成、細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞遷移等。
　　 TRPC1可被配體如外源性小分子、化合物、無機離子和內(nèi)源性物質(zhì)鈣離子濃度變化、PLC、STIM1等激活，也可

5、被受體例如G蛋白偶聯(lián)受體或受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)介導(dǎo)的PLC信號通路激活，被認為是最可能的鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。很多研究表明TRPC1與磷脂酰肌醇有相互作用，例如在細胞極性化過程中，TRP蛋白、PIP2和PIP3受PI3Kγ和PLC的調(diào)節(jié)，在細胞膜上這些分子呈現(xiàn)為相互作用。概括來說，PLC調(diào)節(jié)胞外鈣離子進入胞內(nèi)主要通過和TRPC通道形成分子間的脂質(zhì)連接區(qū)而起

6、作用，這種蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物參與TRPC通道在膜上的定位和表面表達的調(diào)節(jié)。PIP2水解可以影響TRP通道的門控，這種調(diào)解的機制可能與TRPC分子的C末端存在磷脂酰肌醇介導(dǎo)的通道門控位點有關(guān)。PIP2和PIP3可以介導(dǎo)內(nèi)皮縮血管肽-1激活兔冠狀動脈肌細胞上的TRPC1/5/6。
　　 蛋白激酶B（PKB/Akt）參與多個信號通路并扮演著信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子的作用，并且調(diào)控其下游多種分子，在細胞遷移和侵襲、周期調(diào)控、凋亡和增殖、腫瘤

7、血管生成等方面發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號通路是在腫瘤細胞遷移方面比較重要的信號傳導(dǎo)通路，有研究表明用抑制劑Wortmannin抑制PI3K后對堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞的遷移有明顯影響，主要是影響了磷酸化Akt蛋白的作用。
　　 近期有研究表明PI3K/Akt信號通路參與肌細胞的更新和再生，當TRPC1通道被抑制或者抑制Ca2+內(nèi)流會減少PI3K/Akt信號通路的激活，減慢成肌細胞的遷移并

8、且損害肌細胞的再生。反之由TRPC1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流會增強PI3K/Akt信號通路的激活，增強肌細胞的再生能力。
　　 PI3K/Akt信號通路是在腫瘤研究方面一條比較重要的信號傳導(dǎo)通路，在細胞的凋亡和增殖、腫瘤血管生成、細胞遷移和侵襲、周期調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。(1)Akt是PI3K下游最重要的信號分子，它是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，約由480多個氨基酸序列構(gòu)成。Akt分子的氨基酸由N末端到C端依次是N端的PH結(jié)構(gòu)域、中間有

9、酶活性的催化結(jié)構(gòu)域和C末端的短的羧基端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Akt活化后的質(zhì)膜轉(zhuǎn)位過程，它含有7條β折疊，反向平行構(gòu)成β片層一個“疏水區(qū)”。中間有酶活性的催化結(jié)構(gòu)域含有ATP結(jié)合位點，具有催化絲氨酸、蘇氨酸殘基的基團，可發(fā)生磷酸化而被活化，其中308位點的Thr的磷酸化是Akt活化所必需的;C末端是富含脯氨酸的疏水結(jié)構(gòu)域，可跨膜轉(zhuǎn)運，其中含有Akt完全活化所必需的第2個磷酸化位點，即473位的Ser。(2)在正常細胞和腫瘤細胞中

10、，Akt能被多種物質(zhì)如表皮生長因子、激素、細胞外基質(zhì)成分等激活，Akt通過磷酸化和去磷酸化方式調(diào)節(jié)其下游100多種底物分子，從而調(diào)控細胞生長、增殖、凋亡機制。Akt的活化包括兩種，PI3K依賴型和PI3K非依賴型兩種。PI3K是細胞內(nèi)的一種磷脂酰肌醇激酶，它可特異性的活化肌醇基團環(huán)上的第3位羥基，具有蛋白激酶和類脂激酶雙重活性。(3)Akt是PI3K/Akt信號通路的中樞。PI3K/Akt信號通路對多種生命活動的調(diào)節(jié)均依靠Akt蛋白的磷

11、酸化。Akt的活化需要Akt蛋白多肽鏈上的Thr308和Ser473同時發(fā)生磷酸化。具體過程是:當細胞外因子如表皮生長因子作用于細胞膜上的受體酪氨酸激酶(RTK)，受體酪氨酸激酶和配體結(jié)合后激活細胞膜上的PI3K，PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3可與細胞內(nèi)信號蛋白Akt和PDK1、PDK2等蛋白結(jié)合，PIP3與Akt的PH區(qū)結(jié)合后使無活性的Akt等蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞膜上，同時催化Akt蛋白鏈上Ser124和Thr

12、450磷酸化獲得催化活性。Ser124和Thr450磷酸化后使Akt蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出Thr308和Ser473位點。同時，轉(zhuǎn)位到細胞膜的Akt與PDK1等蛋白進一步相互靠近，PDK1蛋白催化Akt的Thr308位點磷酸化，PDK2蛋白催化Akt的Ser473位點磷酸化。Thr308和Ser473的活化最后導(dǎo)致Akt完全活化。活化的Akt引起下游相關(guān)靶蛋白的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致相應(yīng)靶蛋白激活或失活，從而調(diào)控細胞生長與存活、增

13、殖或凋亡、細胞遷移、血管生成等多種細胞活動和生物學(xué)效應(yīng)。
　　 綜上所述，TRPC1和Akt可能在細胞遷移中有交互作用，但是對于在細胞遷移過程中TRPC1和Akt是否有相互作用還不太清楚，本研究利用表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）刺激誘導(dǎo)cos-7細胞這一研究細胞遷移的經(jīng)典模型，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)探討細胞遷移過程中TRPC1和Akt的相互作用。
　　 目的：

14、　　 本實驗通過質(zhì)粒構(gòu)建將兩個目的基因TRPC1和Akt分別重組到熒光表達載體質(zhì)粒pECFP-C1和pEYFP-C1上，得到pECFP-C1-TRPC1和pEYFP-C1-Akt兩個重組質(zhì)粒;利用細胞免疫熒光技術(shù)、重組質(zhì)粒表達融合熒光蛋白技術(shù)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)受體蛋白漂白法等，研究EGF刺激誘導(dǎo)cos-7細胞遷移過程中，TRPC1和Akt是否有

15、相互作用。
　　 方法：
　　 1.利用分子克隆基因重組技術(shù)獲得目的質(zhì)粒利用分子克隆基因重組技術(shù)，將TRPC1、Akt、和YFP的eDNA分別重組到pECFP-C1、pEYFP-C1、pECFP-C1質(zhì)粒上，得到 pECFP-C1-TRPC1、pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三個重組質(zhì)粒。
　　 2.COS-7細胞對EGF的趨化現(xiàn)象COS-7細胞對EGF呈現(xiàn)出一種趨化現(xiàn)象，在EGF一側(cè)細胞膜形皺

16、褶。提前將蓋玻片一角切去一小塊置于六孔板的培養(yǎng)孔內(nèi)，再將COS-7細胞均勻種植于其上。在六孔板內(nèi)的蓋玻片缺角處加10nM的EGF，使細胞發(fā)生EGF的點激活。
　　 3.TRPC1蛋白和Akt蛋白在cos-7細胞中的免疫熒光定位4.熒光融合蛋白在cos-7細胞中的表達及定位5.EGF激活cos-7細胞后熒光融合蛋白的轉(zhuǎn)位6.激光共聚焦顯微鏡檢測FRETpECFP-C1-TRPC1使目的基因TRPC1和CFP融合表達，而pEYFP-

17、C1-Akt使Akt和YFP融合表達。檢測是否TRPC1和Akt發(fā)生了相互作用，就等同于檢測CFP和YFP是否發(fā)生了FRET。CFP蛋白和YFP蛋白構(gòu)成一個能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對，當兩者相隔1.0-10.0nm，并且供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有明顯的重疊，同時供體的發(fā)射光譜和受體的發(fā)射光譜要完全分開，且在供體的激發(fā)波長下對受體無激發(fā)。當以供體的激發(fā)光激發(fā)，供體分子由基態(tài)越遷到激發(fā)態(tài)后，由于偶極-偶極相

18、互作用，供體分子激發(fā)態(tài)能量會以非輻射的形式有效地被傳遞給受體分子。供體和受體之間發(fā)生FRET，將會使供體產(chǎn)生的熒光強度降低，受體發(fā)射的熒光強度增強，同時伴隨供體熒光壽命縮短和受體熒光壽命延長。發(fā)生FRET條件:(1)供體的熒光量子產(chǎn)率較高;(2)供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜能有效重疊（大于30％）;(3)供體和受體之間的距離要在1.0-10.0nm之間[1]。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建pECFP-C1-TRPC

19、1、pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三種質(zhì)粒。
　　 2.在EGF激活的COS-7細胞中，TRPC1和Akt有共定位現(xiàn)象。
　　 3.表達融合熒光蛋白TRPC1后用EGF激活COS-7細胞后，可見TRPC1由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜及近膜區(qū)。
　　 4.表達融合熒光蛋白Akt后用EGF激活COS-7細胞后，Akt未發(fā)生變化。
　　 5.共表達融合熒光蛋白后并用EGF激活COS-7細胞后，TRPC1

20、和Akt由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜及近膜區(qū)，并共定位在細胞移動方向的前極。
　　 6.共表達融合熒光蛋白，TRPC1和Akt未發(fā)生FRET，說明它們之間沒有相互作用。
　　 7.共表達融合熒光蛋白后并用EGF激活COS-7細胞后，TRPC1和Akt發(fā)生了FRET，說明它們之間有相互作用。
　　 結(jié)論：
　　 在EGF激活cos-7細胞遷移過程中，TRPC1和Akt發(fā)生了FRET，表明TRPC1和Akt之間有相互作用