用FRET技術(shù)研究TRPC1和Akt在細(xì)胞遷移中的相互作用.pdf

1、背景：
　　 細(xì)胞遷移(cell migration)是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞遷移需要內(nèi)外因素的配合，外部因素如表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素1等信號(hào)分子;細(xì)胞內(nèi)因素有信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)、細(xì)胞骨架和分子馬達(dá)、參與粘著斑形成的各種分子等。具體過(guò)程為細(xì)胞外信號(hào)分子與細(xì)胞膜表面上的受體結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子將運(yùn)動(dòng)信息進(jìn)一步傳給細(xì)胞遷移的執(zhí)行單位——細(xì)胞骨架和分子馬達(dá)，進(jìn)而完成一系

2、列的遷移活動(dòng)。種類繁多的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子會(huì)相互作用，從而影響細(xì)胞骨架和分子馬達(dá)的分布、結(jié)構(gòu)和活性，達(dá)到精細(xì)調(diào)整細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的目的。
　　 瞬時(shí)受體電位通道(TRP channels)是位于細(xì)胞膜上的一類重要的非選擇性陽(yáng)離子通道超家族，主要通透鈣離子、鈉離子等。所有的TRP通道蛋白均具有6次跨膜結(jié)構(gòu)域，形成4聚體(tetramers)，于5～6段間形成離子通道小孔，通過(guò)細(xì)胞的雙層脂膜供陽(yáng)離子進(jìn)出細(xì)胞。最初人們對(duì)TRP離子通道的認(rèn)識(shí)僅限于

3、感覺(jué)系統(tǒng)，因?yàn)樵撏ǖ劳ㄟ^(guò)感受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的各種刺激，參與痛溫覺(jué)、機(jī)械感覺(jué)以及味覺(jué)的發(fā)生和維持細(xì)胞內(nèi)外的離子穩(wěn)態(tài)等眾多生命活動(dòng)。
　　 TRPC分子的C末端以TRP框?yàn)槠瘘c(diǎn)，存在一個(gè)保守的25個(gè)氨基酸序列區(qū)，它與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的通道門(mén)控位點(diǎn)有關(guān)，TRP結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)TRP通道的功能。TRPC亞家族包括TRPC1-7，共7種亞型。TRPC1在腦、心臟、腎臟、肺、骨骼肌、前列腺、皮膚、睪丸和卵巢都檢測(cè)到其高水平表達(dá)。作為最早被發(fā)現(xiàn)的哺

4、乳動(dòng)物TRP通道，公認(rèn)的TRPC1的功能是參與受體介導(dǎo)的、鈣依賴的平滑肌及腺體的分泌和收縮功能，參與細(xì)胞膜受體激活磷脂酶C(PLC)后所介導(dǎo)的鈣離子進(jìn)入。TRPC1通道是一種非選擇性陽(yáng)離子通道，主要通透的離子為鈣離子、鈉離子。TRPC1通過(guò)參與多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡、樹(shù)突形成、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移等。
　　 TRPC1可被配體如外源性小分子、化合物、無(wú)機(jī)離子和內(nèi)源性物質(zhì)鈣離子濃度變化、PLC、STIM1等激活，也可

5、被受體例如G蛋白偶聯(lián)受體或受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)介導(dǎo)的PLC信號(hào)通路激活，被認(rèn)為是最可能的鈣庫(kù)操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。很多研究表明TRPC1與磷脂酰肌醇有相互作用，例如在細(xì)胞極性化過(guò)程中，TRP蛋白、PIP2和PIP3受PI3Kγ和PLC的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞膜上這些分子呈現(xiàn)為相互作用。概括來(lái)說(shuō)，PLC調(diào)節(jié)胞外鈣離子進(jìn)入胞內(nèi)主要通過(guò)和TRPC通道形成分子間的脂質(zhì)連接區(qū)而起

6、作用，這種蛋白-脂質(zhì)復(fù)合物參與TRPC通道在膜上的定位和表面表達(dá)的調(diào)節(jié)。PIP2水解可以影響TRP通道的門(mén)控，這種調(diào)解的機(jī)制可能與TRPC分子的C末端存在磷脂酰肌醇介導(dǎo)的通道門(mén)控位點(diǎn)有關(guān)。PIP2和PIP3可以介導(dǎo)內(nèi)皮縮血管肽-1激活兔冠狀動(dòng)脈肌細(xì)胞上的TRPC1/5/6。
　　 蛋白激酶B（PKB/Akt）參與多個(gè)信號(hào)通路并扮演著信號(hào)通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子的作用，并且調(diào)控其下游多種分子，在細(xì)胞遷移和侵襲、周期調(diào)控、凋亡和增殖、腫瘤

7、血管生成等方面發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路是在腫瘤細(xì)胞遷移方面比較重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，有研究表明用抑制劑Wortmannin抑制PI3K后對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞的遷移有明顯影響，主要是影響了磷酸化Akt蛋白的作用。
　　 近期有研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與肌細(xì)胞的更新和再生，當(dāng)TRPC1通道被抑制或者抑制Ca2+內(nèi)流會(huì)減少PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，減慢成肌細(xì)胞的遷移并

8、且損害肌細(xì)胞的再生。反之由TRPC1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流會(huì)增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，增強(qiáng)肌細(xì)胞的再生能力。
　　 PI3K/Akt信號(hào)通路是在腫瘤研究方面一條比較重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞的凋亡和增殖、腫瘤血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲、周期調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。(1)Akt是PI3K下游最重要的信號(hào)分子，它是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，約由480多個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。Akt分子的氨基酸由N末端到C端依次是N端的PH結(jié)構(gòu)域、中間有

9、酶活性的催化結(jié)構(gòu)域和C末端的短的羧基端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Akt活化后的質(zhì)膜轉(zhuǎn)位過(guò)程，它含有7條β折疊，反向平行構(gòu)成β片層一個(gè)“疏水區(qū)”。中間有酶活性的催化結(jié)構(gòu)域含有ATP結(jié)合位點(diǎn)，具有催化絲氨酸、蘇氨酸殘基的基團(tuán)，可發(fā)生磷酸化而被活化，其中308位點(diǎn)的Thr的磷酸化是Akt活化所必需的;C末端是富含脯氨酸的疏水結(jié)構(gòu)域，可跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其中含有Akt完全活化所必需的第2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，即473位的Ser。(2)在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中

10、，Akt能被多種物質(zhì)如表皮生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞外基質(zhì)成分等激活，Akt通過(guò)磷酸化和去磷酸化方式調(diào)節(jié)其下游100多種底物分子，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡機(jī)制。Akt的活化包括兩種，PI3K依賴型和PI3K非依賴型兩種。PI3K是細(xì)胞內(nèi)的一種磷脂酰肌醇激酶，它可特異性的活化肌醇基團(tuán)環(huán)上的第3位羥基，具有蛋白激酶和類脂激酶雙重活性。(3)Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路的中樞。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)均依靠Akt蛋白的磷

11、酸化。Akt的活化需要Akt蛋白多肽鏈上的Thr308和Ser473同時(shí)發(fā)生磷酸化。具體過(guò)程是:當(dāng)細(xì)胞外因子如表皮生長(zhǎng)因子作用于細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶(RTK)，受體酪氨酸激酶和配體結(jié)合后激活細(xì)胞膜上的PI3K，PI3K激活后在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3可與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Akt和PDK1、PDK2等蛋白結(jié)合，PIP3與Akt的PH區(qū)結(jié)合后使無(wú)活性的Akt等蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，同時(shí)催化Akt蛋白鏈上Ser124和Thr

12、450磷酸化獲得催化活性。Ser124和Thr450磷酸化后使Akt蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出Thr308和Ser473位點(diǎn)。同時(shí)，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜的Akt與PDK1等蛋白進(jìn)一步相互靠近，PDK1蛋白催化Akt的Thr308位點(diǎn)磷酸化，PDK2蛋白催化Akt的Ser473位點(diǎn)磷酸化。Thr308和Ser473的活化最后導(dǎo)致Akt完全活化?；罨腁kt引起下游相關(guān)靶蛋白的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致相應(yīng)靶蛋白激活或失活，從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與存活、增

13、殖或凋亡、細(xì)胞遷移、血管生成等多種細(xì)胞活動(dòng)和生物學(xué)效應(yīng)。
　　 綜上所述，TRPC1和Akt可能在細(xì)胞遷移中有交互作用，但是對(duì)于在細(xì)胞遷移過(guò)程中TRPC1和Akt是否有相互作用還不太清楚，本研究利用表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）刺激誘導(dǎo)cos-7細(xì)胞這一研究細(xì)胞遷移的經(jīng)典模型，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)探討細(xì)胞遷移過(guò)程中TRPC1和Akt的相互作用。
　　 目的：

14、　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建將兩個(gè)目的基因TRPC1和Akt分別重組到熒光表達(dá)載體質(zhì)粒pECFP-C1和pEYFP-C1上，得到pECFP-C1-TRPC1和pEYFP-C1-Akt兩個(gè)重組質(zhì)粒;利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、重組質(zhì)粒表達(dá)融合熒光蛋白技術(shù)以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)受體蛋白漂白法等，研究EGF刺激誘導(dǎo)cos-7細(xì)胞遷移過(guò)程中，TRPC1和Akt是否有

15、相互作用。
　　 方法：
　　 1.利用分子克隆基因重組技術(shù)獲得目的質(zhì)粒利用分子克隆基因重組技術(shù)，將TRPC1、Akt、和YFP的eDNA分別重組到pECFP-C1、pEYFP-C1、pECFP-C1質(zhì)粒上，得到 pECFP-C1-TRPC1、pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三個(gè)重組質(zhì)粒。
　　 2.COS-7細(xì)胞對(duì)EGF的趨化現(xiàn)象COS-7細(xì)胞對(duì)EGF呈現(xiàn)出一種趨化現(xiàn)象，在EGF一側(cè)細(xì)胞膜形皺

16、褶。提前將蓋玻片一角切去一小塊置于六孔板的培養(yǎng)孔內(nèi)，再將COS-7細(xì)胞均勻種植于其上。在六孔板內(nèi)的蓋玻片缺角處加10nM的EGF，使細(xì)胞發(fā)生EGF的點(diǎn)激活。
　　 3.TRPC1蛋白和Akt蛋白在cos-7細(xì)胞中的免疫熒光定位4.熒光融合蛋白在cos-7細(xì)胞中的表達(dá)及定位5.EGF激活cos-7細(xì)胞后熒光融合蛋白的轉(zhuǎn)位6.激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)FRETpECFP-C1-TRPC1使目的基因TRPC1和CFP融合表達(dá)，而pEYFP-

17、C1-Akt使Akt和YFP融合表達(dá)。檢測(cè)是否TRPC1和Akt發(fā)生了相互作用，就等同于檢測(cè)CFP和YFP是否發(fā)生了FRET。CFP蛋白和YFP蛋白構(gòu)成一個(gè)能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對(duì)，當(dāng)兩者相隔1.0-10.0nm，并且供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有明顯的重疊，同時(shí)供體的發(fā)射光譜和受體的發(fā)射光譜要完全分開(kāi)，且在供體的激發(fā)波長(zhǎng)下對(duì)受體無(wú)激發(fā)。當(dāng)以供體的激發(fā)光激發(fā)，供體分子由基態(tài)越遷到激發(fā)態(tài)后，由于偶極-偶極相

18、互作用，供體分子激發(fā)態(tài)能量會(huì)以非輻射的形式有效地被傳遞給受體分子。供體和受體之間發(fā)生FRET，將會(huì)使供體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度降低，受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)伴隨供體熒光壽命縮短和受體熒光壽命延長(zhǎng)。發(fā)生FRET條件:(1)供體的熒光量子產(chǎn)率較高;(2)供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜能有效重疊（大于30％）;(3)供體和受體之間的距離要在1.0-10.0nm之間[1]。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建pECFP-C1-TRPC

19、1、pEYFP-C1-Akt、pECFP-C1-YFP三種質(zhì)粒。
　　 2.在EGF激活的COS-7細(xì)胞中，TRPC1和Akt有共定位現(xiàn)象。
　　 3.表達(dá)融合熒光蛋白TRPC1后用EGF激活COS-7細(xì)胞后，可見(jiàn)TRPC1由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜及近膜區(qū)。
　　 4.表達(dá)融合熒光蛋白Akt后用EGF激活COS-7細(xì)胞后，Akt未發(fā)生變化。
　　 5.共表達(dá)融合熒光蛋白后并用EGF激活COS-7細(xì)胞后，TRPC1

20、和Akt由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞膜及近膜區(qū)，并共定位在細(xì)胞移動(dòng)方向的前極。
　　 6.共表達(dá)融合熒光蛋白，TRPC1和Akt未發(fā)生FRET，說(shuō)明它們之間沒(méi)有相互作用。
　　 7.共表達(dá)融合熒光蛋白后并用EGF激活COS-7細(xì)胞后，TRPC1和Akt發(fā)生了FRET，說(shuō)明它們之間有相互作用。
　　 結(jié)論：
　　 在EGF激活cos-7細(xì)胞遷移過(guò)程中，TRPC1和Akt發(fā)生了FRET，表明TRPC1和Akt之間有相互作用